Crystallization of Heterodimeric ABCG5/G8 Protein in Lipidic Bicelle Using Hanging Drop Vapor Diffusion

まず、脂質と界面活性剤を含む10%ビセル原液を調製します。これを行うには、5モル%のコレステロールと95モル%のDMPCの混合物であるプレドライ脂質を取り、それに脱イオン水に浸したCHPSO界面活性剤溶液を加えます。ウォーターバスソニケーターを使用して、脂質界面活性剤混合物を氷冷水に溶射し、溶液が透明になるまで連続電力で超音波処理することにより、再懸濁します。

次に、0.2ミクロンの遠心フィルターを使用して、溶解していない成分を取り除きます。次に、氷上で作業し、得られたバイセルストック溶液と事前に調製したタンパク質サンプルを1対4の体積比で混合します。タンパク質バイセル混合物を氷上で30分間インキュベートします。

結晶化のために、48ウェルプレートミックス0.5または1マイクロリットルのタンパク質ビセル混合物を等量の結晶化リザーバー溶液と混合します。次に、48ウェルプレートを使用して吊り下げ滴蒸気拡散モードで結晶化をセットアップし、結晶化セットアップを摂氏20度でインキュベートします。翌日、結晶化トレイをチェックして、カバーガラスが適切に密閉されていることを確認します。

少なくとも1日1回は、偏光板を備えた卓上実体顕微鏡を使用して結晶成長を確認します。最後に、タンパク質結晶を0.2モルのリンゴ酸ナトリウムに浸し、液体窒素を使用して50または100マイクロメートルのクライオループで急速凍結します。データ収集に適した成熟した結晶は、通常1〜2週間以内に出現し、一般的に50ミクロン×100ミクロン×2ミクロンの大きさでした。