Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

まず、安楽死させた解剖マウスの骨から組織を取り除きます。洗浄した骨を、氷上に置かれたFACS緩衝液を含む新しい6ウェルプレートに入れます。骨を2〜5ミリリットルのFACS緩衝液を入れた乳鉢に移します。

骨髄が放出されるまで、円を描くように骨をすりつぶします。3ミリリットルのシリンジで、骨髄を引き上げて洗い流し、均質化します。ホモジネートを別のシリンジに引き込み、70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過して50ミリリットルのチューブに入れます。

2回目の均質化を行う前に、フィルターからFACSバッファーで組織塊をモルタルに戻します。前と同じようにすすぎ組織をろ過します。次に、残りの骨棘をFACS緩衝液で乳鉢に洗い流します。

次に、ピースを15ミリリットルのチューブに洗い流して、最大の収量を確保します。骨髄を消化するには、まず300 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。骨髄ペレットを2ミリリットルの消化混合物に再懸濁します。

混合物を15ミリリットルのチューブに移します。その後、ローテーター上で摂氏37度で45分間インキュベートします。次に、10ミリリットルのFACSバッファーを添加して、酵素消化を停止します。

混合物を70マイクロメートルのセルストレーナーで50ミリリットルのチューブにろ過します。懸濁液を400Gで摂氏4度で7分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。

次に、10ミリリットルのFACS緩衝液を添加して溶解を停止します。次に、前と同じように混合物を50ミリリットルのチューブにろ過します。最後に、混合物を300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、ペレットを100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。骨棘の消化のために、まず、骨棘をボルテックスします。上澄みをデカントし、底に骨を残します。

次に、棘を1ミリリットルの骨棘消化混合物に再懸濁します。チューブをローテーター上で摂氏37度で60分間インキュベートします。最後に、10ミリリットルのFACS緩衝液で消化を停止します。

混合物を濾過し、溶解および消化した骨髄を含む50ミリリットルのチューブに入れます。