Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

まず、単離されたマウス骨髄懸濁液と骨棘懸濁液を混合します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を血球計算盤にピペットで移し、計数します。細胞懸濁液を300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

次に、ペレットを100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。細胞を磁気枯渇の抗体で染色するには、FCブロック、CD45 APC、およびTER-119 APCを追加します。次に、細胞懸濁液をFACS緩衝液で洗浄します。

残りの混合物を遠心分離した後、ペレットを100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。細胞懸濁液をマイクロビーズで染色して磁気を枯渇させるには、マウスIgGと抗APCマイクロビーズを添加します。混合物を氷上で20分間インキュベートします。

LD カラムを 2 ミリリットルの MACS バッファーで洗浄します。細胞をバッファーに再懸濁し、35マイクロメートルのセルストレーナーキャップを装着した5ミリリットルの試験管でろ過します。次に、LDカラムをマグネットセパレータースタンドにセットし、カラムの下に5ミリリットルの試験管を置き、溶出物を回収します。

細胞懸濁液をLDカラムにピペットで移し、試験管内の陰性フラクションフローを回収します。カラムを 1 ミリリットルの MACS バッファーで 2 回洗浄し、溶離液を同じチューブに回収します。LDカラムを新しい5ミリリットルの試験管の上に置きます。

ピペットで、3ミリリットルのバッファーをカラムに分注し、陽性標識細胞を5ミリリットルの試験管に洗い流します。陽性画分と陰性画分の両方を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。CD45 TER-119陰性画分を染色するには、6番目の細胞に10個ごとに各抗体を1マイクロリットル添加します。

懸濁液を氷上に20分間置きます。次に、遠心分離する前に、懸濁液を2ミリリットルのFACS緩衝液で洗浄します。1ミリリットルの緩衝液をペレットに加え、生細胞染色用のヨウ化プロピジウムをピペットで移します。

最後に、サンプルを35マイクロメートルのセルストレーナーで5ミリリットルの試験管にろ過してから、マルチカラーフローサイトメーターで細胞を分析します。動脈内皮細胞は、急性骨髄性白血病微小環境で有意に拡大し、正弦波内皮集団でそれに伴う喪失が見られました。間葉系間質細胞のわずかな拡大は、生後8週齢で見られました。