まず、24時間培養した緑膿菌培養物を取ります。次に、600ナノメートルの光学濃度を0.2に設定し、0.8%生理食塩水を使用して適切な希釈を行います。滅菌ワイヤーループを使用して、CAS寒天プレート上で細菌培養をストリークします。
CAS寒天プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。培養液を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、600ナノメートルの光学濃度を測定します。次に、培養液を遠心分離管に移します。
細菌培養物を4650gで室温で10分間遠心分離します。100マイクロリットルの無細胞上清をピペットで取り出し、96ウェルプレートのウェルに加えます。次に、100マイクロリットルのCAS染料をウェルに加えます。
インキュベーションする前にプレートをアルミホイルで覆います。インキュベーション後、630ナノメートルで分光光度測定値を取得し、シデロフォアの総量をシデロフォア単位パーセントとして計算します。100マイクロリットルの無細胞上清を96ウェルマイクロタイタープレートにピペットで移します。
次に、100マイクロリットルのトリス塩酸を加えます。溶液の分光光度測定値を405ナノメートルで測定します。ピョーシュリン抽出の場合、まず、緑膿菌の48時間培養培養物100ミリリットルを遠心分離管にピペットで移します。
培養物を4650gで室温で10分間遠心分離します。次に、上澄み液に1モルのクエン酸を5ミリリットル加えます。溶液に50ミリリットルの酢酸エチルを加えて、ピオケリンを抽出します。
硫酸マグネシウムで有機相をシリンジフィルターでろ過します。次に、有機相を摂氏マイナス20度で保存します。最後に、320ナノメートルで分光光度測定値を取得します。
3つの臨床分離株と参照株であるPAO1は、CAS寒天培地で増殖すると透明なオレンジ色のハローを発現し、シデロフォア産生を示しました。J3分離株とPAO1の総シデロフォア産生の間に有意差が観察された。ピオベルジン抽出物の分光光度分析では、380ナノメートルに確認可能なピークが示されました。
すべての分離株はピオベルジン産生に陽性でしたが、MR1およびJ3は基準株と比較して産生が低かった。ピオケリンの存在は、320ナノメートルのピークによって確認されました。3つの臨床分離株はすべて、PAO1と比較して有意に高い量を産生しました。
