振動驚愕アッセイを用いたゼブラフィッシュ胚における化学物質の致死率および神経筋毒性の評価(英語)

まず、ゼブラフィッシュの胚を採取し、摂氏28.5度のインキュベーターで受精後72時間まで育てます。同時に、所望の濃度で試験する化学物質を準備します。受精後72時間の胚を調べます。

死んだ胚や孵化していない胚を取り除きます。9ミリリットルのE3培地を入れた6センチメートルの組織培養皿にそれぞれ10個の胚を入れます。これらは露出板と呼ばれます。

各曝露プレートに、化合物名、曝露濃度、および反復回数をラベル付けします。各プレートに1ミリリットルの曝露溶液を最低濃度から加え、プレートを静かに渦巻きさせます。溶解度の低い化合物の場合は、培地10ミリリットル全体を曝露溶液に置き換えてください。

化合物溶液を胚に添加した順序を記録し、インキュベーター内の加湿チャンバー内で摂氏28.5度でプレートを48時間インキュベートします。振動驚愕アッセイを開始するには、コンピュータと振動装置の電源を入れます。構成ファイルのスプレッドシートを作成します。

5 つのプレート位置のそれぞれに曝露情報を含め、化合物、濃度、および繰り返しを指定します。振動驚愕アッセイキットの一般ユーザーインターフェースまたはGUIプログラムを開きます。GUIプログラムでさまざまな位置を選択して、カメラの動きを確認し、カメラの応答を観察します。

サンプルプレートをインキュベーターから取り外します。それらを5つの指定された位置に置き、胚を数分間落ち着かせます。GUIプログラムで、[記録]をクリックすると、新しいウィンドウが表示されます。

このウィンドウで、前に準備した構成ファイルを選択します。サンプルの説明が各位置のサンプルと一致することを確認します。プログラムによって音波パルスがアクティブになるとLEDが点灯するのを観察します。

録画後、カメラは位置1に戻り、ソフトウェアはファイルの圧縮を開始します。測定したサンプルを次のセットと交換し、実証に従って次の分析に進みます。次に、すべての測定プレートから曝露溶液を収集し、ふるいを使用して胚を同時に保持します。

データ解析を開始するには、バーチャルダブまたは別の視聴ソフトウェアでビデオデータを開きます。音波パルスに反応する胚の数を視覚的にスコアリングします。化合物名、複製数、化合物の濃度、および運動性胚の割合をスプレッドシートに記録します。

R スクリプトが埋め込まれた KNIME ワークフローを使用して、ベンチマーク濃度分析を実施します。未処理の野生型胚の運動性の評価では、振動刺激を受けた場合の平均運動性は14.33%であり、クラッチによってばらつきがありました。運動性に対するトリカイン効果の基準濃度計算では、1%濃度で運動性の低下が示され、164.9マイクロモルのベンチマーク濃度50で2.5%を超えると活動が停止しました。.

最適でないアッセイの例では、胚反応に一貫性が見られず、驚愕反応の頑健性に影響を与える発達上の問題が示唆されました。