本研究は、重慶自然科学基金会の重点プログラム(第2020jcyj-zdxmX0027号)および中国国家自然科学基金会プロジェクト(第32270988号)の助成を受けて行われました。

動物実験は、実験動物の使用と世話に関するガイドに従って行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉および倫理委員会によって承認されました。
1. ナノエマルジョン(NE)の調製
<ol><li>水相調製では、0.15 gのポリソルベート80を28.2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、40°Cで撹拌します。</li>
	<li>油相調製には、 表1に示すナノエマルジョンの油相製剤を使用する。ソルニタントリレア酸85、DOTAPおよびRAをスクアレンに溶解し、40°Cで撹拌する。</li>
	<li>一次O/Wエマルジョン調製では、1mL/minの速度で水溶液をゆっくりと滴下しながら、油相を1400rpmで磁気的に攪拌します。高剪断乳化剤を使用して、30,000rpmで6分間混合物を予備乳化します。</li>
	<li>高圧均質化(HPH)の場合、上記で調製した一次O / Wエマルジョンを高圧ホモジナイザーで900バールで12サイクル処理して、160〜190nmの範囲の均質なナノエマルジョンを得る。</li>
	<li>プロセスの最後に、エマルジョンを50mLフラスコに回収し、0.2μmのPESフィルターメンブレンを通してエマルジョンをフィルター滅菌します。</li>
	<li>カテーテルを介してフラスコをシュレンクラインに接続し、三方活栓を回転させてシステムを真空管に接続し、真空ポンプをオンにしてフラスコ内に真空を作り出します。次に、三方活栓を回転させて、システムをアルゴン管に接続し、アルゴンを充填します。この手順を3回繰り返して、フラスコにアルゴンが充填されていることを確認します。</li>
	<li>コルクとシールをパラフィンフィルムに交換し、フラスコをスズ箔で包み、4°Cで保管します。</li>
</ol>2. ナノエマルションの特性評価
<ol><li>粒子径とゼータ電位の検出<ol><li>装置の電源を入れ、レーザー光源が安定するまで30分待ちます。</li>
		<li>NEを超純水で50倍に希釈し、対応するサンプルセルに1mLのサンプルを加えます。</li>
		<li>粒子径を測定するには、温度を25°Cに設定し、分散媒体として水を選択し、測定セルとして使い捨てプラスチック皿を選択します。サンプルをロードし、自動的に測定します。最終結果として、各サンプルの3つの繰り返し測定の平均値を報告します。</li>
		<li>ゼータ電位を測定するには、温度を25°Cに設定します。 分散媒体として水相を選択するため、Smoluchowsiモデルを選択し、測定セルとして折り畳まれた毛細血管セルを選択します。サンプルをロードし、自動的に測定します。最終結果として、各サンプルの3回の反復測定値の平均を報告します。</li>
	</ol></li>
	<li>カプセル化速度と薬物負荷率の決定<ol><li>NEにロードされたRAの量を決定するには、無水エタノールを使用してRAを解乳化し、NEから抽出します。5 μLのサンプルに995 μLのエタノールを加え、355 nmの分光光度計を使用して溶液のRA含有量を測定します。吸光度を標準曲線と比較します。次の式を使用します。 カプセル化=実際のRA負荷/添加された薬剤の重量 薬物負荷量=実際のRA負荷量/サンプルの品質</li>
	</ol></li>
</ol>3.予防接種手順とサンプル収集
<ol><li>予防接種手順とグループ化<ol><li>次の実験グループに従って、0日目、14日目、28日目に免疫するために、6〜8週齢で体重約18〜21gの雌Balb / Cマウスを5匹のセットで投与しました:(1)PBSグループ、(2)オボアルブミン(OVA)グループ、(3)OVA + NE-RA(OVA / NE-RA)グループ、(4)OVA + CNE-RA(OVA / CNE-RA)グループ。</li>
		<li>投与前に混合した、100μLのエマルジョンと100μLのPBSに吸収された15μgのOVAの異なるワクチン製剤を200μLで、大腿四頭筋上部に筋肉内注射してすべてのマウスに免疫します。100μL/後肢を注入します。対照群のマウスには、PBSを単独で投与します。</li>
		<li>安楽死:3回の予防接種の完了から2週間後に、1%ペントバルビタールナトリウム100mg / kgの腹腔内注射により、すべてのマウスを安楽死させます。</li>
		<li>サンプルの収集と処理:安楽死後、はさみを使用してマウスの胸を切り開き、注射器を心臓に直接挿入して約0.5mLの全血を吸引します。血液を室温で2時間放置した後、1800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 血清を採取し、アリコートを採取し、さらなる分析のために-80°Cで保存します。</li>
		<li>全血、脾臓、膣洗浄液(VLF)、気管支肺胞洗浄液(BALF)、鼻洗浄液(NLF)、小腸洗浄液(SILF)を採取します。</li>
	</ol></li>
	<li>脾臓リンパ球の単離<ol><li>マウスをエタノール75%(v / v)に浸して短時間滅菌し、マウスをクリーンベンチに移します。左腹部の皮膚をハサミで切り、脾臓を露出させて取り除きます。</li>
		<li>3 mLのPBSが入ったシャーレに脾臓を入れ、ふるい(200メッシュ、70 μm)と粉砕ロッドを使用して15 mLの遠心分離チューブに粉砕してろ過します。</li>
		<li>細胞を650 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、沈殿物を3mLの赤血球溶解液で懸濁し、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>10 mLのPBSをチューブに加え、よく振って反応を終了し、650 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を捨て、細胞を10mLのPBSに再懸濁し、細胞希釈液20μLを自動セルカウンターに添加して細胞計数を行います。</li>
		<li>細胞を650 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を1640完全培地(1%ペニシリン-ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清)で1 x 106 細胞/ mLに希釈します。</li>
	</ol></li>
	<li>VLF採取:1%BSA / PBSTの75μLで膣を4回すすぎ、洗浄液を混ぜ合わせて1.5mLの遠心チューブに回収し、5000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、ピペットで上清を回収し、-80°Cで保存します。</li>
	<li>BALFおよびNLFコレクション<ol><li>犠牲後のマウスを75%(v / v)エタノールで消毒します。マウスの腹を上に持ち、首をまっすぐにします。はさみを使用してマウスの首の皮膚を縦方向に切開し、鉗子を使用して筋肉を分離し、気管を適切に露出させます。</li>
		<li>小さな横方向の開口部から気管を切断し、ホースを肺に向けて挿入し、シリンジをホースに取り付け、0.5 mLのPBSを肺に注入して抜いた後、3回すすぎを繰り返し、650 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(BALF)を-80°Cで保存します。</li>
		<li>ホースを鼻腔に逆さまにし、シリンジをホースに取り付けて0.5mLのPBSを注入すると、液体が鼻腔を通って1.5mLの遠心分離管に流れ込みます。遠心分離チューブから洗浄液を吸引し、すすぎを2回繰り返し、次いで650 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(NLF)を-80°Cで保存する。</li>
	</ol></li>
	<li>SILFコレクション<ol><li>小腸洗浄液として、0.1 mg/mLトリプシン阻害剤、50 mM/L EDTA-2Na、1 mM/Lフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を含むPBS溶液を調製します。室温で撹拌して溶解し、4°Cで保存します。</li>
		<li>腸管に沿って小腸を切り開き、3mLの小腸洗浄液に浸します。15rpmで垂直振とうし、4°Cで30分間混合します。 1440 x g 、4°Cで20分間遠心分離し、ピペットで上清を回収し、次いで5000 x g 、4°Cで20分間遠心分離する。上清(SILF)を-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. OVA特異的抗体の筋肉内投与後の反応評価
<ol><li>IgGの血清レベル、IgG1、IgG2aのサブクラス、およびVLF、BALF、NLF、SILFの特異的sIgAのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により決定します。</li>
	<li>抗原コーティングの場合は、OVAをコーティングバッファーで5 μg/mLに希釈し、96ウェルELISAプレートを1ウェルあたり100 μLのOVA溶液で4°Cで一晩コーティングします。</li>
	<li>ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、1%BSA/PBSTの250 μLで37°Cで2時間インキュベートしてブロックします。</li>
	<li>ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、以下に希釈したサンプル100 μLを加えて試験し、37°Cで1時間インキュベートします。0.5% BSA/PBST で希釈された血清、VLF、BALF、NLF を 20% ウシ胎児血清 (FCS)/PBST で希釈した SILF。<ol><li>20 μL の血清を 1 mL に希釈し、次にこの希釈した血清 25 μL を 500 μL に希釈します。</li>
	</ol></li>
	<li>1000倍で希釈した血清200 μLをコーティングプレートの1列目に加え、0.5% BSA/PBSTの100 μLを1列目を除くすべてのウェルに加えます。1列目から2列目に100μLを移し、ピペットで10倍混合します。このステップを行8まで繰り返し、100μLの液体を廃棄すると、IgGの検出のために異なる濃度の血清が得られました。</li>
	<li>BALF、NLF、および SILF を 1:1 希釈して IgA を検出します。VLFには、血清と同じ希釈手順を使用してください。</li>
	<li>ELISAプレートをPBSTで5回洗浄します。HRP標識ヤギ抗マウスIgG/IgG1/IgG2a/IgA(PBSTで1:10000に希釈)100 μLを適切なウェルに添加し、37°Cで40分間インキュベートします。</li>
	<li>ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、TMB ELISA基質(高感度)100 μLを加え、プレートを光から保護された場所に5分間移します。TMB基質用の450 nm停止溶液100 μLを直ちに添加して反応を停止します。</li>
	<li>各ウェルの450nmの吸光度(OD)を測定し、ブランク群マウスの血清値の2.1倍を陽性応答値として抗体価を計算します。</li>
</ol>5. ELISpotアッセイ
<ol><li>ELISpot Plusのガイドラインに従い、キットのマウスIFN-γ(ALP)を使用してアッセイを行います。</li>
	<li>密封されたパッケージからプレートを取り出し、滅菌PBS(200μL /ウェル)で4回洗浄します。プレートを1640完全培地(200 μL/ウェル)でコンディショニングし、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>培地を取り出し、ステップ3.2.2で調製した調整濃度のリンパ球懸濁液(100μL/ウェル)をプレートに加え、次いで刺激100μL、すなわち20μg/mLのOVA257~264またはOVA323~339または1640の完全培地を含む1640の完全培地を加える。プレートを37°Cの加湿インキュベーターに5%CO2 で48時間置きます。蒸発を防ぐために、プレートをアルミホイルで包みます。</li>
	<li>細胞懸濁液を廃棄し、プレートをPBS(200 μL/ウェル)で5回洗浄します。検出抗体(R4-6A2-ビオチン)を、0.5%ウシ胎児血清(PBS-0.5%FCS)を含むPBSで1 μg/mLに希釈します。100 μL/ウェルを加え、室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>手順5.2のようにプレートを洗浄します。ストレプトアビジン-ALP(1:1000)をPBS-0.5%FCSで希釈し、100 μL/ウェルを加え、室温で1時間インキュベートします。</li>
	<li>手順5.2のようにプレートを洗浄します。すぐに使用できる基質溶液(BCIP/NBT-plus)を0.45 μmフィルターでろ過し、100 μL/ウェルを添加します。明確な斑点が現れるまで発達します。</li>
	<li>水道水で広範囲に洗って発色を止め、軟質プラスチックを取り除き、プレートを乾かします。</li>
	<li>ELISpot リーダーでスポットを検査してカウントします。</li>
</ol>6. 統計解析
<ol><li>4つのグループのデータ間の差を、一元配置分散分析とそれに続くテューキー多重比較の事後検定で分析します。すべての結果を平均として表し±0.05未満のP値は有意であると見なされました。</li>
</ol>

ナノエマルジョン内包レチノイン酸のマウスにおける免疫原性評価

<ol>
	<li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants.">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+and+cancer+immunotherapy+efficacy+of+a+squalane-in-water+delivery+system+emulsified+by+bioresorbable+poly(ethylene+glycol)-block-polylactide.">Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide.</a> Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Omer, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+formulated+with+synthetic+mycobacterial+cordfactor+(CAF01):+A+versatile+ddjuvant+for+vaccines+with+different+immunological+requirements.">Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements.</a> Plos One. 3 (9), e3116 (2008).</li><li>Slutter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+vaccination+with+N-trimethyl+chitosan+and+PLGA+based+nanoparticles:+Nanoparticle+characteristics+determine+quality+and+strength+of+the+antibody+response+in+mice+against+the+encapsulated+antigen.">Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen.</a> Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).</li><li>Nochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogel+antigenic+protein-delivery+system+for+adjuvant-free+intranasal+vaccines.">Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines.</a> Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).</li><li>Henriksen-Lacey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+cationic+charge+and+antigen+adsorption+are+important+properties+for+the+efficient+deposition+of+antigen+at+the+injection+site+and+ability+of+the+vaccine+to+induce+a+CMI+response.">Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.</a> J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).</li><li>Zhong, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovaccines+mediated+subcutis-to-intestine+cascade+for+improved+protection+against+intestinal+infections.">Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections.</a> Small. 18 (1), e2105530 (2022).</li><li>Mora, J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+homing+of+protective+T+and+B+cells+to+the+gut+after+subcutaneous+immunization+in+mice.">Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).</li><li>Burger, C., Shahzad, Y., Br&#252;mmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traversing+the+skin+barrier+with+nano-emulsions.">Traversing the skin barrier with nano-emulsions.</a> Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).</li><li>Lodaya, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+design,+optimization+and+evaluations+of+an+&#945;-tocopherol-containing+self-emulsified+adjuvant+system+using+inactivated+influenza+vaccine.">Formulation design, optimization and evaluations of an &#945;-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine.</a> J Cont Release. 316, 12-21 (2019).</li><li>Carmona-Ribeiro, A. M., P&#233;rez-Betancourt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+nanostructures+for+vaccines+design.">Cationic nanostructures for vaccines design.</a> Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).</li><li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications.">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).</li><li>Nie, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+approach+to+overcome+mucosal+entrapment+of+DNA+nanoparticles+for+oral+gene+delivery+of+glucagon-like+peptide+1.">Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1.</a> Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).</li><li>Lou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+self-amplifying+mRNA+vaccines+by+cationic+lipid+nanoparticles:+The+impact+of+cationic+lipid+selection.">Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection.</a> J Cont Release. 325, 370-379 (2020).</li></ol>

著者は、この作品に利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸を開発しました。従来のNEアジュバントと比較して、以下の2つの利点があります。まず、一般に、O/W NEの表面は負電荷が高いため、抗原を直接ロードすることは困難です。カチオン性NEは、ペプチドまたはタンパク質抗原を効果的?...

アジュバントは、免疫系を刺激してワクチンに対してより強く反応させることにより、ワクチンの有効性を高めるためによく使用され、それによって特定の病原体に対する免疫力を高めます1。ナノエマルジョン(NE)アジュバントとは、油相と水相の一定の割合を乳化して油中水型(W / O)または水中油型(O / W)の形態のエマルジョンを生成することにより、熱力学的安定性を備えたコロイド分散システムを指します2。O / Wナノエマルジョンアジュバントは、注射部位でサイトカインとケモカインを生成し、単球、好中球、好酸球などの重要な免疫細胞の急速な凝集と増殖を誘導し、免疫応答を増強し、抗原の免疫原性を改善することができます3。現在、3種類のナノエマルジョンアジュバント(MF59、AS03、AF03)がワクチンへの使用許可を受けており、良好な安全性と有効性が示されています4。
しかし、粘膜免疫は、従来の非経口ワクチン接種で現在認可されているアジュバント製剤では十分に対処されていません5。レチノイン酸(RA)は、免疫細胞の腸内ホーミングを誘導することが報告されていますが、極性が低く、水への溶解性が低く、光と熱の安定性が低いため、強力な腸内ワクチン接種での使用が制限されています。ナノエマルジョンは、親油性の高い薬物のバイオアベイラビリティを高める機会を提供し、O / Wエマルジョンアジュバントのオイルコアは、RA6などの非極性物質の溶解に適しています。したがって、ナノエマルジョンは、全身免疫および粘膜免疫の二重応答効果を達成するために、RAの担体として使用することができる。
中性または陰イオン送達システムと比較して、カチオン送達システムは比較的効率的な抗原カプセル化および送達能力を有し、抗原の免疫原性を高めることができる7,8,9。種々のアジュバント系のカチオン性表面電荷は、それらのアジュバント効果10,11,12にとって重要である。カチオン電荷は、注射部位でのワクチンの保持を延長し、抗原提示を増加させ、体内の細胞性免疫の刺激を延長する重要な要素です12。
以上の考察に基づき、RAと抗原を効果的に共送達するカチオン性ナノエマルジョンを開発した。ナノエマルジョンの粒子サイズおよびゼータ電位は動的光散乱(DLS)を用いて決定され、OVAと組み合わせたナノエマルジョンの全身および粘膜免疫応答を筋肉内注射によって評価した13。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

カチオン性ナノ構造は、樹状細胞の成熟、ROS生成、および抗原取り込みを促進し、抗原特異的免疫応答を促進するアジュバントおよび抗原送達システムとして浮上しています。近年、レチノイン酸(RA)は粘膜免疫応答を活性化する効果があるため、ますます注目されています。しかし、RAを粘膜アジュバントとして使用するためには、その溶解、負荷、および送達の問題を解決する必要があります。ここでは、カチオン性脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOTAP)、レチノイン酸、油相としてのスクアレン、界面活性剤としてのポリソルベート80、および共界面活性剤としてのトリオレイン酸ソルビタン85で構成されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(CNE-RA)送達システムについて説明します。その物理的および化学的特性は、動的光散乱と分光光度計を使用して特徴付けられました。抗原(オボアルブミン、OVA)とCNE-RAの混合物によるマウスの免疫は、OVA単独と比較して、マウスの膣洗浄液および小腸洗浄液中の抗OVA分泌性免疫グロブリンA(sIgA)のレベルを有意に上昇させた。このプロトコルは、CNE-RAのアジュバント効果の調製、特性評価、および評価のための詳細な方法を記述しています。

合計で、4つのナノエマルジョン製剤を調製し、それらの粒子サイズ(図1)、それらのゼータ電位およびそれらのカプセル化効率によって特徴付けられる。粒子径は160〜190nm付近に集中し、DOTAPの添加によりナノエマルジョンのゼータ電位が逆転した。OVA特異的血清IgGおよび血清中のそのサブグループ抗体レベルは、3回目の免疫の2週間後に検出されました。ナ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development and Evaluation of a Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid System for Mucosal Vaccination at JoVE.com

著者スポットライト:粘膜ワクチン接種のためのカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸システムの開発と評価

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(RA)を開発しました。FDA承認のRAをナノエマルジョンに添加することにより、ナノエマルジョンの筋肉内注射後、抗原特異的sIgAが膣および小腸で促進された。

卵子特異的な全身および粘膜応答を促進するためのアジュバントとしてのカチオン性ナノエマルジョン内包レチノイン酸

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

私たちは、一連の感染として免疫応答を引き起こす粘膜ワクチンに取り組んでおり、感染を防ぎ、感染を阻止する可能性を秘めています。私たちは、全身免疫応答と粘膜免疫応答の両方を引き起こす筋肉内注射によるオボアルブミンによる緊張性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸送達システムを開発しました。将来の研究では、腸関連疾患の動物モデルを使用して、ワクチン防御を強化するカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸の効果とメカニズムをさらに評価できます。

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

548 ビュー.  Third Military Medical University. 私たちは、一連の感染として免疫応答を引き起こす粘膜ワクチンに取り組んでおり、感染を防ぎ、感染を阻止する可能性を秘めています。私たちは、全身免疫応答と粘膜免疫応答の両方を引き起こす筋肉内注射によるオボアルブミンによる緊張性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸送達システムを開発しました。将来の研究では、腸関連疾患の動物モデルを使用?...

ビデオ: 著者スポットライト:粘膜ワクチン接種のためのカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸システムの開発と評価

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

免疫・感染学

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

小さなインドのマングースにおけるイオフェノキ酸類似体の分析 (ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)経口狂犬病ワクチン接種生物学的マーカーとしての使用のためのセラ

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

疑似型ウイルスによるSARS-CoV-2に対する血清中和の評価

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

著者スポットライト:Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...