扁桃体単核細胞は血液細胞よりも関連性が高く複雑であり、その単離は粘膜免疫を伴う病理における免疫細胞応答の研究を可能にする。我々が確立した技術は、ex vivo研究のためにその完全性を維持しながら、粘膜組織から多数の免疫細胞を回復することを可能にする。この方法は非常に簡単ですが、収量を最大化するためには、扁桃腺を迅速かつ注意して処理する必要があります。
原稿テキストに記載されているように、ヒト扁桃組織を実験室に輸送する。次に、細胞ストレーナーを150 x 25ミリメートルの培養皿の上に置きます。すべての解剖器具を別の皿に入れて、無菌状態に保ちます。
彼らは以前に資格を持っておらず、感染性物質が含まれている可能性があるため、すべての主な標本は注意して処理する必要があります。次に、扁桃腺を出した細胞が含まれるため、バイアルからストレーナーにPBSを注ぎます。滅菌鉗子を使用して、扁桃腺をバイアルから滅菌鉗子を使用して培養皿に移す。
必要に応じて、さらにPBSを追加してグリッドを浸します。解剖は扁桃腺あたり約45分かかります。この間、扁桃腺は良好な生存率と細胞収量を確保するために水没することが重要です。
鉗子およびメスを使用して、焼灼された血まみれおよび筋腫組織を除去する。メスと湾曲したピンセットを使用して、組織を直径の半分未満の小片に切ります。小片を常に浸すことができるように、すべての組織をカットします。
細胞のストレーナーに組織のいくつかの部分を置きます.白い間質の非常に薄い層だけが残るまで、ガラスの害虫でグリッドにそれらを削ります。グリッドを詰まらせないように、ストロマを取り除いて捨てます。
その後、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液をグリッドに移し、最後に1回削ります。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液を無菌バイアルに移す。グリッドと細胞ストレーナーをPBSで一度洗い、PBSをバイアルにも移します。
進む前に、セルサスペンションを室温で5分間ベンチに置きます。新しい50ミリリットルのバイアルの上に無菌70マイクロメートルのふるいを置きます。10ミリリットルのピペットで細胞懸濁液をふるいにそっと移します。
ふるいが詰まっている場合は、無菌1ミリリットルピペットチップの背面を使用して、ふるいを通して細胞を削ります。必要に応じてふるいを頻繁に変更します。250回gで細胞を摂氏4度で10分間遠心分離する。
遠心後、上清を捨てる。バイアルを軽くたたいてペレットを再中断し、35ミリリットルのPBSで細胞を再中断する。細胞分離の第1段階を完了するには、新しいバイアルの上に新しい70マイクロメートルのふるいを置き、10ミリリットルのピペットでセルサスペンションをその上に移します。
より明確な細胞溶液を得るために、新しい50ミリリットルのバイアルに15ミリリットルの密度勾配培地を加えることから始めます。TMC溶液を密度勾配媒体の上に注ぎ、混合を最小限に抑えるように注意してください。次に、加速度とブレーキをオフにして室温で30分間、溶液を1000倍gで遠心する。
遠心分離機からバイアルを取り出した後、10ミリリットルのピペットを使用して上層を取り除き、廃棄します。TMC と密度勾配媒体の間のインターフェイスを妨げないでください。その後、無菌1ミリリットルピペットチップでTMCを取り出し、新しい50ミリリットルバイアルに移します。
細胞を洗浄するには、まず、2%のウシ胎児血清および2ミリモルEDTAを含むPBSの50ミリリットルを加える。その後、チューブを摂氏4度で10分間250倍gで遠心分離します。もう一度細胞を洗いますが、今度はチューブを摂氏4度で10分間400倍にします。
RPMI 1640を10%熱不活性化FBS、2ミリモルL-グルタミン、および抗生物質溶液で補ってR10培地を調製する。TMCを10ミリリットルのR10で再中断します。次に、セルをカウントします。
これらの細胞は、原稿に記載されているように、即時に使用するか、または将来の使用のために凍結することができます。TMCを染色し、抗体でインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて特徴付けた。TMCは、血液から末梢単核細胞に存在する主要な免疫細胞型すべてを含んでいた、 PMBCを省略した。
しかし、B細胞を除くすべての細胞タイプの周波数は、TMCではPBMCよりも低かった。サイトカイン産生における細胞活性化を研究するために、TMCはレジキモドR848で一晩刺激した。青色でプロットされたTMCは、IFN Lambda 2/3およびIL-8を除くすべてのサイトカインを生産したが、生産量はPBMCよりも低かったが、緑色でプロットされた。
折り目はR848刺激を無刺激と比較して増加し、赤色で示される。精製および単離されたTMC、青色、および扁桃組織ブロック、オレンジ、インフルエンザAウイルス、IAVで24時間刺激した。IFN産生はTMCで検出されたが、組織外植物がサイトカイン分泌および細胞活性化の研究のための最良のモデルではないことを示す組織ブロックの上清ではなかった。
有毒薬物C1とR848による刺激で前培養した後、TMCおよびPBMCは生存率についてアッセイされた。TMC は C1 に対してより敏感でした。これは、将来の治療法における新薬は、細胞株、PBMC、または組織外植物だけでなく、組織からの細胞でテストされるべきであることを示唆している。この手順により、全血からのPBMCのようなTMCを使用し、特定の細胞型の精製、細胞培養、フローサイトメトリーまたは凍結などの同じ細胞実験を行うことができます。
TMCsの単離は、粘膜免疫を伴う病理における二次リンパ器官における免疫応答を、関連するモデルにおいてより良く特徴付けることを可能にする。
