著者らは、プロシージャの起動、初期設定のためにエミリーMaireyとエマニュエルDonnadieuに感謝します。

1。ヒト宿主の細胞と細菌培養<ol><li>継代1および5％（v / v）のCO 2の加湿インキュベーター中37℃で9の間の文化HUVECを。継代細胞は使い捨てのフローチャンバー（μ-スライドVI）の75 cm 2の培養フラスコや実験的な文化にメンテナンス文化を提供するために、トリプシン/ EDTAで80％コンフルエントに近づくとき。 </li><li>継代するフラスコから培地を撤回、10mlのPBSで細胞を洗浄、トリプシン/ EDTA 1.5mlでそれを撤回し、交換してください。細胞は37℃で5分間インキュベーター、細胞培養にデタッチすることができます</li><li> 15 mlのコレクションチューブに細胞培養培地の10mlで細胞を集めます。ペレットを室温で5分間の遠心分離（200 gで）、を持つ細胞。遠藤- SFMの4 mlに細胞をサスペンドは、製造業者の指示に従って、10％（v / v）のFBSで補充しMalassez室でそれらを数える。 </li><li>チャネルへミリリットル懸濁液（3 × 4個 ）当たり1 × 10 6 HUVEC細胞30μlを紹介し、細胞が5％の雰囲気で加湿インキュベーター中、37 °（V / V）CO 2で3時間付着することができます。井戸を埋めるために遠藤- SFMの120μlの追加のボリュームを追加します。細胞はサブコンフルエント単層（図2）を形成すべきである。 </li><li> Nを成長するケロッグのサプリメントと37クロラムフェニコールの5μg/ mlを含むGCB寒天プレート上髄膜炎を発現するGFP（IPTG誘導性プロモーターの制御下で、この場合のひずみ8013表現GFPで）、· V / 5％（含む湿った大気中のC V）16時間CO 2。 </li></ol> 2。宿主細胞への個々の細菌の初期付着<ol><li>予め温めておいた遠藤- SFMは、37℃で120分間を10％（v / v）FBSとインキュベートを含む° Cを5％（V /を含む湿った雰囲気の中で、0.05のOD600にGCB寒天プレート上で成長させた細菌の濃度を調整します。 v）を穏やかに振盪（130 rpm）の下でCO 2、。全体の潜伏期間のための培養液中に1mMのIPTGを添加することによりGFPの発現を誘導。 </li><li> 37℃で試料温度を維持するために加熱されたプラットフォームを搭載した倒立顕微鏡℃の舞台上で使い捨てのμ-スライドを配置</li><li>無菌ガラスビーカーに2％（v / v）のFBS添加予め温めておいた遠藤- SFMを注ぎ、この培地で無菌50mlの注射器を埋める。注射器に&quot;エントリ&quot;チューブを接続し、培地を導入することで埋める。 </li><li>チャンバー内に空気を導入避けるために、慎重に、μ-スライドする&quot;エントリ&quot;チューブを接続します。その後、慎重に貼付、もう一方の端に&quot;出口&quot;チューブとはチャンバー&quot;出口&quot;から約1 cmの距離に培地を使用してチャネルを埋める。 </li><li>細菌のOD600を測定し、遠藤- SFMは2％（v / v）のFBSを含むで0.15に調整する。個々の細菌を見るためには、任意の凝集体が細菌サンプルの積極的なボルテックスによって破壊されている必要があります。 </li><li>遠藤- SFMの代わりに100μlのは、タンクに2％（v / v）のFBS培地を補給し、残りの細菌の集合体のサンプリングを避けるためにボルテックスソリューションの上部から採取した菌液100μLを加える。 </li><li>慎重にチャンバー内に細菌を注入するためにコックを回して、μ-スライドに200μlのボリュームをご紹介。 </li><li> 15分間0.044ダイン/ cm 2の密着性と互換性のせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバーに2％（v / v）のFBS、37℃に維持温水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。 </li></ol> ビデオ1または図3の例を参照してください。このステップの後、いずれかのセクション3、4または6に移動します。 3。宿主細胞への個々の細菌の初期付着の定量化<ol><li>液体がまだ循環している間15分間の初期接着した後、ランダムに10個のフィールドの画像を取得する。 </li><li>フィールドあたりのadherant細菌の平均数をアクセスするためには、ImageJのソフトウェア8を 、使用して取得された画像を分析する。これは、次のように行われます：まず第一に、各イメージは、細胞からバックグラウンドを最小限に抑えながら、個々の付着蛍光細菌を強調するために&quot;イメージ&quot;メニューにある&quot;しきい値&quot;ウィンドウを使用して閾値処理される。その後、一つ一つの細菌は、プラグインを使用して、&quot;セルカウンター&quot;（で、カウントされます<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ）。各画像のデータはExcelスプレッドシートで報告され、フィールドごとの付着性細菌の平均数を定量化するために平均化されています。 </li></ol> 4。宿主細胞への付着性、個々の細菌の流れに抵抗の測定<ol><li>プログラムは、シリンジポンプは、5分間3から100ダイン/ cm 2の範囲のせん断応力を生成するために、セットアップ。 </li><li> 5分の終わりには、ステップ3.1で説明したようにランダムに選ばれた10個のフィールドを取得するとして、その流れでPRを停止買収にIOR。 </li><li>ステップ3.2で説明したように取得された画像を分析し、フィールドごとに、残りの細菌の平均数を定量化する。 </li></ol> 5。微小コロニーに分離された付着細菌の成長を測定する<ol><li>数時間のために選ばれたせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバー内に10％（v / v）のFBS、37℃に維持温​​水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。一つのフレームでのリアルタイムビデオ顕微鏡のための記録画像は5分ごと。 </li><li>ビデオ顕微鏡に続いて、シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。細菌の増殖の例は、ビデオ2で見ることができます。 </li></ol> 6。付着細菌microcoloniesの流れに抵抗の測定<ol><li>細胞表面上に大規模なmicrocoloniesの形成後（step5.2）フローのアプリケーションの前に2〜3の両方の細胞の画像（位相コントラストによる）と細菌を（GFP蛍光により）取得。実験の残りの部分では、買収のプロトコルは、蛍光のみを監視します。 </li><li> 5秒ごとに一つのフレームで5分（300〜100ダイン/ cm 2）と記録的なイメージのために高いせん断応力を加える。 </li><li>シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。 </li><li>次に、最初の&quot;出口&quot;チューブを外し、慎重に、チャネルを空にしないようにしてから、&quot;エントリ&quot;チューブを取り外す前に、井戸を埋めるために予め温めておいた新鮮な培地を加​​える。 </li><li>定量的に細菌の抵抗でせん断応力の影響を判断するには、メッキのアッセイは次のように実行することができます：残りの培地を収集し、チャネルから、残りの培地を除去する（両方の洗浄があるPBS120μlの、で二回μ-スライドを洗うまた、収集された）。 </li><li> 37℃で5分間トリプシン/ EDTAを50μlを添加して感染細胞を剥離し、前のステップで収集した懸濁液を用いてこの分離されたサンプルを混ぜる。 </li><li> 37プレートのインキュベーション後、翌日の単位（CFU）を形成するコロニーの数を決定するために、PBSとプレート三重のGCB寒天プレート、、上に10μlの割合で希釈系列を行います°のインキュベーターでC 5％（v / v）のCO 2。 </li></ol> 動画3と4はpilV変異体と野生型の菌株を比較する。 7。 microcoloniesからバクテリア分離<ol><li> 2.8手順2.1を繰り返して、フローチャンバーで細胞に感染し、感染は30分間続行することができます。 </li><li> 2分の期間は10ダイン/ cm 2に流量を増加させることにより未結合の細菌を除去し、感染が2時間継続することができます。 </li><li> 0.15ダイン/ cm 2までの流れを減らす。 </li><li>毎時間、フローチャンバーから出てくる培地のドロップを集める。 </li><li> GCB寒天プレート上のサンプルとプレート、それらの段階希釈を行います。 </li><li> 37プレートのインキュベーション後、翌日のコロニー形成単位の数（CFU）、℃インキュベーター内で5％（v / v）のCO 2とを決定する。 </li></ol> 8。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> 図1：手続きの流れの存在下で観察して測定できる携帯単分子層のさまざまなステップ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> 図2：実験（せん断応力の欠如）の先頭にフローチャンバ内の内皮細胞単層。約50内皮細胞はサブコンフルエント単層で構成されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> 図3：細胞表面上の細菌の初期付着のグラフィック表現。 3つのフィールドの値は（0044ダイン/ cm 2）期待されるフィールド間の変動のアイデアを与えることが示されている。 ビデオ1。時間の関数（0044ダイン/ cm 2）のような細胞単層上の細菌の初期付着の可視化。 GFPを発現する細菌が流れる媒体の方向に従っている。フィルムが60倍に加速され、ビデオの実際の持続時間は10分です。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> ビデオは2。初期付着菌後7時間の期間のための細胞の表面（1000倍加速）で増殖させた。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> ビデオ3。増殖後、細胞表面上の整備士microcoloniesのアル抵抗は5分を10ダイン/ cm 2にせん断応力のレベルを増加させることによって試験が野生型のmicrocoloniesは60倍加速耐性がありますした。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> pilV変異体によって形成されたビデオ4。Microcoloniesは、フローの増加（10ダイン/ cm 2）によって破壊されています。この変異体は、microcolonies下の原形質膜のリモデリングを誘導するために失敗し、そのためより多くのずり応力の増加（ビデオは60倍に高速化されている）5に非常に敏感です。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a>

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	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

せん断応力のと、一般的に生物学における力学的側面の重要性がますます認識されています。例えば、リンパ球の接着と血管壁に圧延の過程におけるタンパク質のセレクチンファミリーの高度に適応した接着剤の特性は、プロセス内のせん断応力を導入することによって認識されている。上記の手順は、グラム陰性菌のナイセリア髄膜炎菌に適用されたが、病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。せん断応力の重要性は、他の病原体や他の感染部位にも示されている。せん断応力によって条件付け細菌付着は、尿路病原性大腸菌 （UPEC）9日に発見さFimHアドヘシンの研究によって記述されています。セレクチンと同様に、FimHとその宿主細胞の受容体間の相互作用は、せん断誘起の機械的な力9によって強化されることが示されたと毒素原性大腸菌のCfaEアドヘシンは、せん断依存を経由して腸上皮細胞への接着を媒介することも報告されている機構10。我々は、ストレプトコッカスagalactiae毛が流れの条件11の下上皮細胞にこの病原体の付着のために不可欠であることをこの章で説明する層流チャンバーアッセイのプロトコルを使用して、報告した。このような研究は私たちのフローチャンバーアッセイは、せん断応力の条件下で宿主細胞 - 病原体相互作用を調査するための有用なツールであることを確認してください。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> μ-スライドVI 0.4フローキット</td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td>シリンジPlastipak 50ミリリットルルアーロック</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 300865 </td></tr><tr><td>タイゴンチューブR3603 3.2 × 4.8ミリメートル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3方活栓、オスルアーにルアー2メス</td><td> Bio - Rad社</td><td> 7328103 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td>倒立顕微鏡、ニコン</td><td>ニコン</td><td> EclipseのT I </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松市</td><td> ORCA 285 CCDやORCA 3 - CCD </td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td>フリーウェア （ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ） </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

細菌感染の間に相互作用のシーケンスでは、病原体およびそのホストとの間で起こる。宿主の細胞表面への細菌付着がしばしば病因の初期と判断するステップである。実験的に接着が主に静的な条件で検討されていますが、密着性は実際に液体を流れるの存在下で行われます。細菌とその宿主との間の最初の出会いは、多くの粘液は、上皮細胞の表面に沿って流れる粘膜レベル、口、肺、腸、目、などで発生します。後感染症における、病原体は時折そのような敗血症、敗血症や髄膜炎など生命を脅かす病気を引き起こす血液の循環をアクセスする。これらの感染症の決定的な特徴は、血液の循環の存在下で内皮細胞と相互作用するこれらの病原体の能力である。それは病原体に対する機械的な力を生成するので、例えば、液体、粘液や血液を流れるの存在は、密着性を決定する。液体つを流れるの影響を特徴づけるためには、通常ダイン/ cm 2で表される固定壁の近くに移動する流体によって単位面積当たりの行使接線力であるせん断応力の概念、を指します。せん断応力の強度が異なる容器の種類、サイズ、オルガン、場所等（0-100ダイン/ cm 2）に応じて大きく異なります。毛細血管の循環は非常に低いせん断応力の値に到達しても一時的に数分を1に数秒の間の範囲の期間中に停止することができます。細動脈におけるスペクトルのせん断応力のもう一方の端に100ダイン/ cm 2に達することができます。異なる生物学的プロセスでせん断応力の影響が明らかに内皮3白血球の相互作用の中に、インスタンス用として実証されています。細菌付着の過程で考慮に入れて機械的なパラメータを取るように私たちは使い捨てのフローチャンバー4の使用に基づいて、実験手順の利点を取った。宿主細胞は、フローチャンバーで栽培され、蛍光細菌は、シリンジポンプによって制御フローに導入されています。我々は当初、細菌性病原体髄膜炎菌 、敗血症や髄膜炎の責任グラム陰性菌に私たちの調査を集中。セル1に付着し、細胞表面5に増殖すると、新しいサイト6（図1）植民地化するデタッチする：手順は、私たちは細菌の能力へのせん断応力の影響を研究するために許可されてここで説明する。補完的な技術情報は、参考文献7に記載されています。ここで紹介するせん断応力の値は、文献に見られる値を表すために私たちのこれまでの経験1とに基づいて選択されました。プロトコルは、研究の目的に応じて、特定の調整を行っている病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K ビュー.  INSERM U970. 感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

免疫・感染学

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...