合成細胞アプリケーションのための小さな単層小胞(SUV)によるバルク無細胞発現反応(英語)

まず、バイアルを静かに回転させながら、POPC脂質を含むガラスバイアルにアルゴンヌの穏やかな流れを吹き込みます。脂質がバイアルの底でフィルムとして乾燥したら、緩く蓋をしてから、乾燥剤に移します。1時間後、0.5ミリリットルの超純脱イオン水を加えて脂質膜を溶解します。

溶液を2分間ボルテックスします。次に、2つのフィルターサポートと脱イオン水を浸します。それらを各内膜サポートに置きます。

次に、100ナノメートルのポリカーボネートフィルターを2つの内部膜サポートの間に置き、押出機の外部ケーシングとリテーナーナットで一緒に保持します。セットアップを押出機スタンドに置き、ミニ押出装置のセットアップを終了します。次に、脂質水混合物を1ミリリットルのガスタイトシリンジに入れます。

スイングアームクリップを使用して、シリンジをミニ押出機の一方の端に固定します。2番目のシリンジをミニ押出機のもう一方の端に挿入し、完全に押し下げられていることを確認します。次に、元のシリンジから空のシリンジに脂質水混合物を装置を通して渡します。

押し出しを11回繰り返した後、SUVを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。無細胞発現プロトコルを組み立てるために、可溶性SFGFPまたはグルタミン酸受容体SFGFPの変異体、マウスRNAse、およびSUV溶液をコードする1〜3 DNAプラスミドをバイアルにピペットで溶液します。超純脱イオン水を加えて、反応量を20マイクロリットルにします。

無細胞発現溶液を96ウェル円錐形Vボトムプレートに移します。プレートリーダーで37°Cのプレートリーダーで4〜5時間インキュベートします。ゲイン 100、励起 485 ナノメートル、発光 528 ナノメートル、実行時間 5 時間、インターバル測定を 2 分ごとに 1 回の読み取りでプレートリーダーをセットアップします。

GFPシグナルを2分ごとに測定し、無細胞反応をリアルタイムでモニタリングします。可溶性SFGFPは、3つのタンパク質すべての中で最も高い発現を示しました。