まず、1.5ミリリットルの微量遠心チューブにGUV外部緩衝液を調製します。スペルミジン、ATP、GTP、CTP、UTP、クレアチンリン酸、酢酸マグネシウム、グルタミン酸カリウム、HEPES、水酸化カリウム、フォリン酸を混合。グルコース、およびアミノ酸ストック。
超精製脱イオン水を加えて、溶液の最終容量を1ミリリットルにします。次に、ドラフトで、15ミリリットルのガラスバイアルに17.3マイクロリットルのPOPCストック溶液を追加します。これに、PEO-b-PBD共重合体1.08マイクロリットルをピペットで。
ガラスバイアルにアルゴンガスをゆっくりと吹き込み、バイアルを回転させてクロロホルムを蒸発させます。次に、1.2ミリリットルの軽質鉱物油をガラスバイアルにピペットで入れます。脂質と油を最高速度で10〜20秒間渦巻きます。
ガラスバイアルを摂氏約50度のオーブンに20分間入れてから、最高速度でさらに10〜20秒間ボルテックスします。次に、270マイクロリットルのGUV外部溶液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで移します。これに、5モルの塩化ナトリウムと4.5モルの塩化カリウムをそれぞれ15マイクロリットルでピペットします。
GUVアウターソリューションの上に300マイクロリットルの脂質と油の混合物を静かにピペットで移します。インキュベーション後、溶液1〜3、可溶性sfGFPまたはグルタミン酸受容体sfGFPの変異体をコードするDNAプラスミド、マウスRNAse、および1モルのスクロースをバイアルにピペッティングしてCFE反応を組み立てます。超純脱イオン水を加えて、反応量を20マイクロリットルにします。
20マイクロリットルの反応混合物が入った微量遠心チューブに、600マイクロリットルの脂質-油混合物を加えます。ピペットで1分間激しく上下に動かし、反応を乳化します。チューブ内のオイル層の上にインナーエマルジョンをやさしく重ねます。
摂氏4度で2000gで10分間遠心分離します。次に、マイクロ遠心チューブから余分な油と外部溶液を慎重にピペットで取り出します。GUVペレットを残りの溶液に穏やかに混合して再懸濁します。
GUV溶液を清潔な96ウェルの透明な平底プレートに移し、インキュベーションします。密封したプレートをプレートリーダーに移し、摂氏37度で5〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを倒立共焦点顕微鏡に置きます。
GUVを含む関心領域に焦点を合わせ、488ナノメートルの励起波長で画像をキャプチャします。画像をTIFF形式で保存します。画像処理ソフトウェアで画像を開きます。
明るさ/コントラスト設定パネルをクリックして開きます。次に、明るさとコントラストを調整して、蛍光タンパク質が見えるようにします。GUVにカプセル化された野生型グルタミン酸受容体無細胞発現反応は、優れた発現と膜局在を示しました。
PRSP-グルタミン酸受容体は凝集し、点状形成されやすいという問題がありました。可溶性sfGFPはGUVSで発現し、GUVルーメンに留まりました。
