まず、150マイクロリットルのタグメンテーションバッファーを、タグ付けされたマウス筋芽細胞サンプルが入ったサンプルチューブに加えます。EDTA、SDS、およびプロテイナーゼKを各チューブにピペットで挿入します。チューブの内容物をボルテックスしてよく混合し、PCRマシンで55°Cで2時間チューブをインキュベートします。
次に、各サンプルを200マイクロリットルのフェノール-クロロホルム混合物を含む1.5ミリリットルの遠心分離チューブにピペットで移します。チューブの内容物をボルテックスして混合します。遠心分離が完了したら、最上層を新しい1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
次に、200マイクロリットルのクロロホルムを新しいチューブに加えてから、再びボルテックスして遠心分離します。最上層を新しいチューブに吸引します。次に、550マイクロリットルの100%エタノールを各サンプルチューブに加え、反転させてよく混合します。
次に、チューブを摂氏マイナス80度に1時間置き、DNA沈殿を誘発します。溶液を最高速度で15分間遠心分離し、DNAペレットを得ます。上清を注いだ後、ペレットを75%エタノールで洗浄してから、再度5分間遠心分離します。
次に、ペレットを21マイクロリットルの二重蒸留水に再懸濁します。ライブラリ調製に使用するPCRをセットアップします。サンプルごとに異なるN7XX IlluminaプライマーとユニバーサルN5XXプライマーを使用してください。
PCRサイクル番号を装置に入力して、PCRを実行します。増幅後、アガロースゲル上で3マイクロリットルのライブラリーを電気泳動します。CUT&Tagライブラリーは、主に約300塩基対のタグ付きモノヌクレオソームを含んでいました。
qPCRは、H3K4me1マークがMYOD1遺伝子のエンハンサー領域で高度に濃縮されていることを示しました。
