まず、ヒト子宮線維芽細胞の70〜90%のコンフルエント培養を行います。フラスコから培地を吸引します。5ミリリットルの温かいカルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を洗浄します。
DPBSを吸引した後、4ミリリットルの温かいトリプシンEDTAを各フラスコにピペットで入れます。細胞が剥離するまで、細胞を摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、各フラスコに6ミリリットルの点滴と中和液を加えます。
次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。ピペットを使用して懸濁液をよく混合し、細胞計数のために10マイクロリットルのアリコートを取ります。10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーと混合する。
染色した細胞懸濁液を血球計算盤に移し、細胞カウントを行います。次に、細胞懸濁液を300Gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを温かい線維芽細胞培地に再懸濁します。
次に、マイクロ流体臓器チップの基底チャネルを200マイクロリットルの線維芽細胞培地で洗浄します。次に、200マイクロリットルの温めた膣上皮培地で頂端チャネルを洗浄します。ピペットチップで出口を塞ぎながら、200マイクロリットルの完全な膣上皮培地を頂端チャネル入口に追加します。
入口と出口のチップ容量が等しくなるまで、媒体を分注します。次に、ピペットチップをピペットから放し、チップをインレットに残します。ヒト子宮線維芽細胞懸濁液50マイクロリットルを基底チャネル入口にゆっくりとピペットで移し、同時に出口から吸引する。
約2マイクロリットルの細胞懸濁液がピペットチップに残っている場合は、ピペットチップをインレットから取り外します。15ミリリットルのチューブラックでプラグチップを逆さまにします。インキュベーション後のチップの細胞付着を確認します。
次に、基底チャネルの出口をピペットチップで塞ぎます。次に、ピペットプランジャーを押し下げることなく、200マイクロリットルの線維芽細胞培地を基底チャネル入口に追加します。チップをピペットから放し、媒体が重力流によってチャネルを通って出口ピペットチップに自由に流れるようにします。
線維芽細胞播種チップを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素を補給します。
