RNAシーケンシングのための均質化されたヒト筋間脂肪組織サンプルからの単一細胞核の単離

均質化されたヒト筋間脂肪組織を氷上の1.7ミリリットルの低結合チューブに集めた後、ホモジネートに10%Triton X-100の14マイクロリットルを追加します。.チューブを氷の上で暗闇で10〜15分間インキュベートし、3分ごとにボルテックスします。別の15ミリリットルの円錐管に、100ミクロンと40ミクロンのセルストレーナーを100マイクロリットルのDPBSで事前に濡らします。

100ミクロンのセルストレーナーでホモジネートをろ過します。1.7ミリリットルの低結合チューブを400マイクロリットルの均質化緩衝液ですすぎ、懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーまでろ過します。次に、100ミクロンの濾液で得られた懸濁液を40ミクロンのセルストレーナーでろ過します。

溶液を予冷した2本の1.7ミリリットル低結合チューブに均等に分配します。チューブを2700Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上部の脂質層と上清を捨て、最初のチューブに約50マイクロリットルを残します。.

気泡を作らずに20回静かにピペットで上下させ、ペレットを最初のチューブに再懸濁し、懸濁液を新しい1.7ミリリットルの低結合チューブに移します。次に、1.7ミリリットルの低結合チューブに500マイクロリットルの核分離培地を加え、ピペッティングで混合します。チューブを1000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。

上清を取り除き、チューブに約50マイクロリットルを残し、ペレットを再懸濁するために穏やかにピペットで移動します。次に、200マイクロリットルの核分離培地を加え、懸濁液を混合します。生細胞染色液を1滴加え、氷上で暗所でインキュベートします。

15分後、30ミクロンのセルストレーナーで溶液をろ過します。核溶液を混合し、10マイクロリットルをセルカウンティングチャンバースライドに加えます。自動セルカウンターを使用して核をカウントします。