まず、1〜2ミリリットルの付着防止リンス液を15ミリリットルの円錐管にピペットで移します。チューブを渦巻かせて表面をコーティングします。次に、付着防止液を取り除いた後、5ミリリットルのDPBS溶液をチューブにピペットで入れます。
必要になるまでコーティングされたチューブにキャップをします。ヒト腸オルガノイドドームを含むプレート内の任意の培地をピペットで取り出します。1ミリリットルのピペットで、1ミリリットルの冷たいDMEM/F-12培地を直接ドームに加え、プレートから取り外します。
培地をさらにミリリットルピペットでピペットで取り、残っているオルガノイドを採取します。懸濁液をコーティングされた15ミリリットルの円錐管に移します。懸濁液を上下にピペットで動かしてオルガノイドを崩壊させ、目的のオルガノイドサイズの均一なフラグメント懸濁液が作成されます。
次に、懸濁液のアリコートをピペットで取り出してカウントします。残りのサスペンションを氷の上に置きます。平底の96ウェルプレートの各ウェルの底にXYグリッドを描きます。
50マイクロリットルのDPBSをウェルにピペットで入れます。5マイクロリットルのアリコートを各ウェルに移します。直径50〜200マイクロメートルのオルガノイドの総数を手動でカウントします。
次に、与えられた式を使用してオルガノイド懸濁液の体積を計算します。オルガノイドを数えた後、残りの凝集懸濁液を含むチューブから上清と濁った層を取り除きます。次に、2ミリリットルの冷たいDMEM/F-12をペレットに直接ピペットで移します。
懸濁液を200Gで室温で5分間遠心分離します。動物由来のシステムの場合、動物由来のマトリックスオルガノイドペレット1個に40マイクロリットルの冷水を加えます。オルガノイドを上下にピペットで動かし、マトリックスに分配します。
マトリックスオルガノイド混合物を、滅菌済みの予熱済み24ウェル組織培養プレートの中央に静かに移します。プレートを摂氏37度で30分間インキュベートし、ドームのゲル化を確保します。次に、インキュベーション前にドームを乱さずに、0.5ミリリットルの温かい腸内オルガノイド増殖培地をウェルの側面にピペットで入れます。
マトリックス4ゼノフリーオルガノイドシステムの場合、50マイクロリットルの3Xオルガノイド増殖培地をスフェロイドペレットに加えます。次に、選択したマトリックス4つのゼノフリーオルガノイドの100マイクロリットルを懸濁液にピペットで移します。40マイクロリットルのヒドロゲルオルガノイド混合物を24ウェル組織培養プレートの中央に加えます。
プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルの側面に沿って0.5ミリリットルのオルガノイド増殖培地をピペットで掴みます。次に、プレートを摂氏37度で再びインキュベートし、5%の二酸化炭素を補給し、95%の湿度でインキュベートします。
