初代海馬ニューロンのトランスフェクションの2日後に共焦点顕微鏡を使用してイメージングの準備をします。生細胞チャンバーアタッチメントを60倍主観的およびレンズオイルで摂氏37度まで温め、チャンバーを5%CO2に平衡化します。アイピースを使用して、カーゴタンパク質を含むチャネル内のトランスフェクションされたニューロンを同定します。
次に、スキャンをクリックしてニューロンを画像化し、SCI-5チャネルの軸索初期セグメントを特定します。視野を32 x 128ピクセルの長方形のボックスに設定し、軸索の初期セグメントから遠位の50〜150ミクロンの軸索の領域を画像化するように移動します。貨物輸送の方向性とROIの向きを記録し、名前を付けて保存を押してファイルとして保存します。
ボックス上のドットは、後続の画像の上部と右側に表示されることに注意してください。画像の中で細胞体に最も近い側と軸索末端に最も近い側を記録し、コマグラフポリラインの正しい向きを確保します。561 レーザー出力を 1.40 に、ピンホールを 7.8 に、サイズを 128 ピクセル四方に、速度を 32 フレーム/秒に設定します。
ゲインを調整して、バックグラウンド信号に遮られることなく、個々の貨物小胞の輸送を視覚化します。ROI ドロップダウンメニューから [四角形 ROI の描画] を選択し、視野全体をカバーするように ROI を描画します。次に、右クリックして[Use as stimulation ROI S1]を選択します。次に、ND setupタブで、acquire imageをクリックして、プレスティミュレーションの参照画像を収集します。
次に、スティミュレーションをROI S1、インターバルを遅延なし、持続時間を1.64秒、ループを7に設定します。次に、画像取得をクリックして、刺激後の参照画像を収集します。待機、取得なし、2分を選択して、蛍光貨物が漂白されたROIを再入力するための回復期間を提供します。
取得間隔、遅延なし、持続時間5分、ループ、8、615を選択します。ND設定タブの「apply stimulation settings」ボタンをクリックし、「run now」をクリックします。また、2つのニューロンから輸送ビデオを収集して分析します。
視野を画像全体にリセットし、ROIボックスを含む561チャンネルと647チャンネルのニューロン全体の画像を収集します。画像が撮影されたXY座標を記録し、タンパク質発現の固定後確認を行います。カーゴタンパク質mAPLのシナプトフィジンを発現するトランスフェクションニューロンのライブセルイメージングを、このプロトコルを用いて行った。
軸索初期セグメントのニューロファシンの外部ドメインも標識されました。貨物輸送のイメージングは、関心のある軸索領域で行われました。さらにイメージング後の免疫蛍光分析により、タウタンパク質とmAPLシナプトフィジンの共発現が確認されました。
