軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響の測定のための初代海馬ニューロンの解離とプレーティング

まず、胚性マウスの脳から海馬を解剖し、解剖した組織を氷冷カルシウムおよびマグネシウムフリーバッファーまたはCMFに入れます。次に、CMFを取り外し、新鮮な冷たいCMFでティッシュを4回すすぎ、すすぎの合間にチューブを優しく回転させます。次に、ろ過した0.125%トリプシン溶液を加え、摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとに渦巻きます。

インキュベーション後、トリプシン溶液を取り出し、氷冷したCMFで2回洗浄します。次に、3ミリリットルのトリプシン不活化溶液を追加します。次に、細胞を解離するために、3ミリリットルの注射器に取り付けられた14ゲージの針で2秒のドローを使用して30回滴定します。

15ゲージの針で30回、次に16ゲージの針で20回、続いて18ゲージの針で20回、2秒のドローで滴定を続けます。次に、21ゲージの針を使用して3秒間のドローを15回行い、細胞の解離を完了します。顕微鏡スライド上に細胞懸濁液の液滴を載せて、細胞凝集物を確認します。

次に、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して5ミリリットルのFBSをろ過します。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管内のFBSに穏やかに重ねます。細胞を200 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

FBSを取り外し、ペレットを1ミリリットルの温かい抗生物質抗生物質を含まない神経基礎培地に再懸濁します。.細胞懸濁液を0.4%トリパンブルーで希釈し、細胞数を求めます。温めたポリD-リジンコーティングされた4ウェルチャンバースライドに、750マイクロリットルの抗生物質を含まない神経基礎培地に細胞をプレートします。

37°C、5%CO2の湿度制御チャンバーで細胞をインキュベートします。