シスプラチンおよびパラホルムアルデヒド固定によるノテキシン損傷マウスから単離された骨格筋細胞の生/死染色

まず、ヨードデオキシウリジンで標識したノテキシン損傷マウスから単離された骨格筋細胞を1ミリリットルの冷血清遊離DMEMに再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用してカウントします。ドラフトの下にシスプラチンストックを添加し、最終濃度を25マイクロモルにします。チューブを10秒間ボルテックスし、室温で1分間インキュベートします。

10%FBSを含む氷冷DMEMで反応を急冷し、氷の上に置きます。細胞をペレット化して再懸濁した後、35μmの細胞ストレーナーで懸濁液をろ過します。ドラフトの下に、ろ過したパラホルムアルデヒドストック溶液を加えて、細胞懸濁液とボルテックスを30秒間固定します。

2ミリリットルの細胞染色培地またはCSMで遠心分離により2回洗浄します。最終洗浄後、上清を約60マイクロリットルに吸引し、ペレットを完全に再懸濁します。CSMで調製した表面抗体染色ミックスを2.5倍40μL加え、20分間隔でボルテックスしながら1時間インキュベートします。

サンプルをCSMで2回洗浄した後、上清を吸引し、ペレットをフリックします。細胞を透過化するために、ヒュームフードの下で、ボルテックスしながら0.5ミリリットルの氷冷メタノールを滴下します。細胞を1ミリリットルのCSMで遠心分離により2回洗浄します。

最後の洗浄後、上清を約60マイクロリットルに吸引し、ペレットを完全に再懸濁します。40 μLの細胞内抗体染色混合物で細胞をインキュベートし、20分ごとにサンプルをボルテックスします。細胞を1ミリリットルのCSMで2回洗浄した後、サンプルを0.5ミリリットルのインターカレーターイリジウム溶液とボルテックスに再懸濁します。