ゲル活性アッセイのための細胞培養および小動物組織サンプルからの濃縮ミトコンドリア画分の単離(英語)

まず、充填した細胞ペレットを、細胞ペレット容量の7倍に等しい低張緩衝液の容量に再懸濁します。細胞懸濁液をPotter-Dounceホモジナイザーに移し、氷上で2分間インキュベートして細胞を膨潤させます。600 RPMで回転するモーター駆動のテフロン乳棒に結合されたホモジナイザーで8〜10回のストロークを実行して、細胞膜を破砕します。

等量の高張緩衝液を細胞懸濁液に添加して、等張性環境を生成します。ホモジネートを10〜15ミリリットルのチューブに移します。摂氏4度で1, 000Gで5分間遠心分離し、上清を1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに集めます。

ミトコンドリア粗画分を収集するには、16, 000Gのマイクロフュージで摂氏4度で2分間遠心分離します。上清を捨て、ミトコンドリアが豊富なペレットを0.5ミリリットルの緩衝液Aで再懸濁します。2つのチューブの内容物を1つに結合し、前に示したように遠心分離します。最後の遠心分離後、ペレットを300マイクロリットルのバッファーに再懸濁しますA.Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量化します。

ハサミを使って、20〜30ミリグラムの動物組織をカットします。ストレーナーを使用して、ホモジナイズバッファーで組織を3〜4回洗浄し、小さな破片が失われないように注意します。緩衝液を含む組織片をホモジナイザーに移します。

肝臓、脾臓、腎臓組織の場合、LVM Potterでモーター駆動のテフロン乳棒を使用して600RPMで4〜6回の上下ストロークを行います。