In-Gel Activity Assaysによる哺乳類組織画分中のミトコンドリアスーパーコンプレックスの解析

まず、哺乳類の細胞培養物または組織から得られたミトコンドリア画分を青色の天然サンプルバッファーに再懸濁して、1ミリリットルあたり約10ミリグラムのタンパク質濃度を得ます。ミトコンドリア膜を可溶化するためには、ジギトニンを添加して、ミトコンドリアタンパク質1グラム当たり4グラムのジギトニンの比率を得る。穏やかなピペッティングで混合し、氷上で5分間インキュベートします。

懸濁液を20, 000Gのマイクロフュージで摂氏4度で25分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。上清を新しいチューブに集め、最初の再懸濁量の3分の1に相当する5%クーマシーブルーG-250を加え、ピペッティングで混合します。冷陰極Aバッファーを電気泳動装置の上部チャンバーに、アノードバッファーを下部チャンバーに加えます。

30〜100マイクログラムのミトコンドリアタンパク質をポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。電気泳動後、ゲルをプラスチックの箱に入れます。ゲルを覆うのに十分な量のゲル活性アッセイ溶液を適量加え、室温で穏やかに振とうしながらインキュベートし、光から保護します。

適切なバンドができたら、アッセイ溶液を取り出します。ゲルを蒸留水で2回洗浄してから、40%メタノールと10%酢酸で30分間固定します。ゲル活性アッセイの解析により、マウスとヒト細胞における明確なスーパーコンプレックスの集合パターンが明らかになりました。

遊離複合体1はマウス細胞で観察されましたが、ヒトミトコンドリアでは検出されませんでした。複雑な4パターンは、ヒト細胞株では類似していましたが、SCAF1の変異変異体によりマウス細胞株では異なっていました。