CAR-T細胞における酸素依存性CAR発現のフローサイトメトリー評価

まず、培養したCAR形質導入T細胞を、2ミリリットルのTGMを含む2つの12ウェルプレートにプレート化します。1つのプレートを5%の二酸化炭素、摂氏37度未満の加湿インキュベーターに直接置きます。酸素レベルが1%にプリセットされた移動式二酸化炭素、酸素窒素インキュベーターチャンバーに他のプレートを置きます両方の条件下で24時間ごとにプレートから500,000個の細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に収集します。

チューブを500Gで5分間遠心分離します。上清を取り除いた後、1ミリリットルのPBSを細胞ペレットに静かにピペットで入れます。ペレット化した細胞を50マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。

次に、1〜100希釈のフィコエリトリン標識抗フラグ抗体を50マイクロリットル加えます。サスペンションをピペットで動かして十分に混合します。インキュベーション後、各チューブに1ミリリットルのFACSバッファーを加えます。

混合懸濁液を500Gで5分間遠心分離します。次に、各チューブから上清をピペットで取り出します。次に、細胞を200マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。

得られた細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移します。細胞懸濁液上でフローサイトメトリーを行い、表面のキメラ抗原受容体の発現を決定します。新しいチューブをブランクとCARとしてセットアップします。

FSCA、FSCH、SSCA、SSCH、PE、および FITC チャネルをクリックします。次に、4つの散布図を作成して、単一細胞、生細胞、GFP陽性細胞、およびPE陽性細胞を順次同定します。10, 000個の単一生細胞を収集するためのパラメータを設定します。

[データの取得] をクリックします。セルの収集が安定したら、[データの記録]をクリックします。ネガティブコントロールに従ってゲートの位置を決定するには、EGFPおよびフィコエリトリン陽性の細胞をゲートして、フィコエリトリン陽性および蛍光強度中央値を測定する。

CARを標的とする2つの低酸素感受性は、正常酸素条件と比較して、低酸素条件下でのCARの発現が有意に高いことを示しました。