まず、磁気活性化細胞選別組織保存溶液へのCIED移植中に、大胸筋より250ミリグラムのSATを取得します。コラゲナーゼ/ディスパーゼ1ミリリットルあたり1ミリグラムを10ミリリットルの冷たいハンクスバランス塩溶液で調製します。.層流キャビネットの下で、500マイクロリットルのコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で組織を1立方ミリメートルにミンチします。
4.5ミリリットルのコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液を混合物に加え、トリチュレートした組織をきれいな50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。ペトリ皿の蓋を5ミリリットルのコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で洗い、チューブに加えます。チューブを摂氏37度で30分間インキュベートし、毎分20回転に設定したチューブローテーターでインキュベートします。
消化を止めるには、10ミリリットルの完全内皮細胞増殖培地をチューブに注ぎます。消化した混合物を14ゲージのベンフロンカニューレでトリチュレートした後、70μmのセルシーブで濾し、10ミリリットルの0.5%PBS-BSAバッファーですすいでください。濾液を300Gで室温で10分間遠心分離し、上清を捨てます。
死細胞を除去するには、微量遠心チューブで採取した細胞ペレットに200μリットルの死細胞除去ビーズを加え、インキュベートします。次に、30μmのフィルターが付いた液体分離カラムをセパレーターマグネットに取り付け、その下に15ミリリットルの遠心分離チューブを置きます。死細胞除去結合バッファーでカラムを洗浄した後、サンプルビーズ懸濁液を添加します。
重力下で通過させ、溶出液を回収します。次に、回収した生細胞溶出液を遠心し、得られたペレットを0.5%PBS-BSAの400マイクロリットルに再懸濁します。懸濁細胞を20マイクロリットルの抗CD31コーティング磁気ビーズと摂氏4度で20分間インキュベートします。
遠心分離後、細胞ペレットを0.5%PBS-BSAの500マイクロリットルに再懸濁します。セパレーターマグネットに30μmフィルター付きカラムを取り付け、その下に15ミリリットルの遠心チューブを置きます。細胞マイクロビーズ懸濁液をカラムに加え、重力下で通過させます。
カラムを洗浄した後、新しい15ミリリットルの遠心分離チューブに入れ、0.5%PBS-BSAの1ミリリットルをカラムに加えます。カラムプランジャーを押して、CD31陽性画分を回収します。前に示したようにサンプルを遠心分離し、細胞ペレットを1ミリリットルの完全微小血管内皮細胞増殖培地に再懸濁します。
懸濁液を2%ゼラチンコーティングされた24ウェルプレートの2つのウェルに分注します。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で2〜4週間培養し、細胞がほぼ80%のコンフルエントになるまで培養します。
