マツノザイセンチュウを用いたIn Vitro Pinus pinaster シュート培養物の確立と感染

まず、認定されたPinus pinasterの種子を流水で洗って、大きな破片を取り除きます。次に、一般的な洗剤溶液を使用して、激しく攪拌しながら細かい破片を洗います。フローフードに市販の漂白剤溶液を加え、種子が覆われるまで15分間激しく混合します。

漂白剤溶液を捨てた後、滅菌した水道水で種子を3回すすいでください。次に、種子を80%エタノールに15分間激しく攪拌しながら浸します。エタノールを処分した後、滅菌した超純水で種子を3回洗浄します。

マツの発芽のためには、滅菌された種子コートを滅菌機械旋盤で壊します。松の実を分離し、滅菌した湿った濾紙を入れた密閉容器に入れて一晩水和させます。翌日、水和した松の実を摂氏4度で7日間層状にすることで、休眠状態を解消し、発芽を同期させます。

次に、発芽するまで暗所で松の実を摂氏25度に保ちます。無菌発芽マツを2週間、または主茎が成長し始めるまで、制御された環境条件に移します。2週間後、根の上の苗の地上部をメスで切り取り、滅菌したシェンクヒルデブラント培地に移します。

前述のように、制御された環境条件で培養を維持します。滅菌メスでシュートの基部にある無骨な組織を切断することにより、定期的に継代培養します。滅菌ピンセットを使用してシュートクラスターを新鮮な増殖培養培地に移します。

次に、マイクロステム伸長のために、1リットルあたり3グラムの活性炭を含むシェンクヒルデブラント培地にマイクロシュートを接種します。次に、細長い芽を植物ホルモンや活性炭を含まないシェンクヒルデブラント培地に入れます。マイクロシュートの底に100〜150の混合ライフステージ滅菌松檻線虫を追加します。

前述のように、制御された環境条件で培養を維持します。インビトロマツノマツノコの樹木の確立と感染は、マツノザイセンチュウとの共培養から1か月以内にクロロティック針の出現を示しました。