PLAドット取得を実施してタンパク質相互作用を局在化させた後、異なる条件の画像を開いてImageJで解析するためのパラメータを調整します。これらのパラメーターを、マクロ・プログラムのデータとともに決定し、指定します。背景を削除するには、[処理して背景を減算] をクリックします。
プレビュー機能を使用して、さまざまなローリングボール半径をテストします。ノイズを除去するには、[処理]、[ノイズ]、および [ノイズ除去] をクリックします。次に、nucleus メニューの Process and Smooth をクリックして、スムーズ機能を適用し、充填を改善します。
次に、[画像]、[タイプ]の順にクリックし、[8ビット]を選択して8ビット画像に変換します。その後、Image、Adjust、最後にThresholdに移動して、しきい値を調整します。閾値を調整して、画像内のすべての核またはドットを視覚化し、過飽和や構造の崩壊を回避します。
また、値をメモし、異なる画像でテストします。マスクに変換するには、[処理]、[バイナリ]、[マスクに変換] の順にクリックします。核で、[Process]、[Binary]、[Fill Holes]の順にクリックし、[Process]、[Binary]、および[Watershed]をクリックします。
PLA ドットで、[プロセス]、[バイナリ]、および [Watershed] をクリックします。核を数えるには、さまざまな核の面積または長さを測定して、平均サイズを推定します。近似値を使用してパーティクルを解析するには、[解析](Analyze)および[パーティクルを解析](Analyze Particles)をクリックします。
サイズを 15 無限に設定し、オプションを確認します。マスクの表示、結果の表示、結果のクリア、マネージャーへの追加、エッジでの除外。PLAドットをカウントするには、ドットの面積または半径を測定して、平均サイズを推定します。
ROI マネージャーの ROI ごとに、[分析] と [粒子の分析] をクリックします。サイズを0.02〜3に設定します。オプションの確認、マスクの表示、結果の表示、結果のクリア、集計、エッジの除外を行います。
画像に存在する各核の核あたりのドット数を示す結果を保存します。Nek4 Ku70の相互作用は、対照細胞やDMSO処理細胞と比較して、エトポシド処理の20分後、1時間後、3時間後のDNA損傷後に核内で増加しました。エトポシド処理は、DMSOコントロールと比較してNek5トポイソメラーゼ2-β相互作用を有意に増加させました。
Gamma-H2AX染色は、エトポシド処理の20分後に増加し、最大3時間上昇したままであり、持続的なDNA損傷応答を示しています。
