まず、60%から70%のコンフルエント度で培養したU2OS細胞を採取し、0.25%トリプシン-EDTAを使用して分割します。丸い13mmカバースリップを追加して、60mmプレートを準備します。複数の13ミリメートルの丸いカバースリップを含む60ミリメートルプレートに400、000個の細胞をプレートします。
次に、培地をプレートから取り出します。25マイクロモルのエトポシドを含む培地を添加し、細胞を20分、1時間、3時間インキュベートします。インキュベーション後、培地をプレートから取り出します。
細胞をPBSで3回洗浄します。細胞を固定するには、カバースリップ表面を覆うのに十分な量の氷冷メタノールを加え、摂氏20度で10分間インキュベートします。次に、カバースリップをPBSで3回洗い、湿度チャンバーに移します。
PBSを剥がした後、30〜40マイクロリットルの透過化バッファーを加え、室温で20分間インキュベートします。その後、カバースリップをPBSで3回洗います。次に、サンプルからPBSをタップします。
PLAキットに含まれている30〜40マイクロリットルのブロッキング溶液を各カバースリップに追加します。プレートを37°Cに予熱した湿度チャンバーで1時間インキュベートします。次に、キットに含まれている抗体希釈液で一次抗体を希釈します。
ブロッキング溶液をタップオフした後、一次抗体溶液を各カバースリップに加え、湿度チャンバー内で摂氏4度で一晩インキュベートします。マイナスプローブとプラスプローブ1〜5を抗体希釈液で希釈します。ドンキーアンチマウスMINUSとドンキーアンチヤギPLUSの組み合わせ、ドンキーアンチマウスMINUSとドンキーアンチラビットPLUSなどを組み合わせて使用してください。
次に、一次抗体溶液をタップオフし、TBSTで一度洗浄します。余分なTBSTを軽くたたいた後、20マイクロリットルのPLAプローブ溶液をカバースリップに加えます。次に、予熱した湿度チャンバーで摂氏37度で1時間インキュベートします。
5xライゲーションバッファーを高純度水で希釈します。PLAプローブ溶液をタップオフし、TBSTで一度洗浄します。次に、ライゲーション溶液に1:40希釈でリガーゼを添加し、サンプルに塗布します。
予熱した湿度チャンバーで摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、5倍増幅バッファーを高純度の水で希釈します。ライゲーション溶液をサンプルから取り出したら、TBSTでサンプルを一度洗浄します。
ポリメラーゼを1:80希釈で増幅溶液に加え、サンプルにアプライドします。予熱した湿度チャンバーで摂氏37度で100分間インキュベートします。増幅バッファーをタップオフし、SSCバッファーで2回、それぞれ10分間洗浄します。
サンプルをPBSで2回洗浄した後、一次抗体溶液を各カバースリップに加え、室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、一次抗体溶液をタップオフし、TBSTで3回洗浄します。次に、二次抗体溶液を各カバースリップに加え、室温で20分間インキュベートします。
その後、TBSTで5回、SSCバッファーで2回、0.01x SSCバッファーで2回洗浄します。最後に、異なるウェルから画像を取得するか、スリップ領域を覆って、不均質なインキュベーションによるアーティファクトを回避し、すべてのチャネルを同じ名前パターンで保存します。
