RBPR2およびSTRA6ペプチドのキネティックアッセイを設定するには、マウスRBPR2、変異型RBPR2、およびSTRA6ペプチドをランニングバッファーで連続希釈します。制御ソフトウェアを開き、Kinetic SOAR Affinityウィザードを選択します。注入シーケンスダイアログで、フローセル 2 をアクティブに、フローセル 1 を参照としてフローパス 2.1 を選択します。
セットアップダイアログで、[起動サイクルの実行]オプションをオンにし、ソリューションをバッファとして入力し、サイクル数を指定して[次へ]をクリックします。次に、注入パラメータダイアログに移動し、120秒の接触時間、毎分30マイクロリットルの流量、300秒の解離時間などのサンプルパラメータを入力します。再生パラメータについては、再生溶液をグリシン塩酸に設定し、接触時間を30秒、流量を毎分30マイクロリットルに設定し、[次へ]をクリックします。
サンプルダイアログで、ペプチドの名前、分子量、および濃度を入力し、[次へ]をクリックします。ラック位置ダイアログで、希釈したペプチドを、1〜100マイクロモルのさまざまな濃度の個々の120マイクロリットルサンプルとしてラック上の指定された位置に割り当てます。イジェクトラックをクリックし、すべてのバイアルを挿入します。
その後、[次へ] をクリックし、[実行プロトコルの準備] ダイアログで [開始] をクリックします。ファイル名を入力し、[保存]をクリックします。ソフトウェアで、スタートメニューをクリックし、評価を選択します。
ファイルを開き、ドロップダウン選択メニューからFC-2.1を選択して、msRBP4、変異型msRBPR2、およびmsSTRA6ペプチドの関連および解離フェーズの参照セルブランク減算アクティブセンサーグラムを分析します。次に、ドロップダウンの[Kinetics]または[Affinity]ボタンをクリックして、[Surface Bound]を選択します。select curvesダイアログで、table in the tableにチェックを入れ、nextをクリックします。
次に、データの選択ダイアログに移動し、空白の減算されたセンサーグラムを表示します。「Kinetics and Affinity」をクリックします。デフォルトのパラメータをそのまま使用し、カーブフィットのフィットをクリックします。
レポートタブで、平衡解離定数Kd、関連率KaまたはKon、および解離率KdまたはKoffを確認します。テキストタブのKineticsデータセンサーグラムを制限付き形式で保存し、その値を使用してグラフをプロットします。
