Retinal Lysates 中の GPCR-11-cis Retinal Protein Complex を定量するための分光光度法

まず、安楽死させたマウスの眼球を摘出し、氷冷緩衝液で眼を均質化します。ホモジネートを16, 000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。水溶性タンパク質やその他の汚染物質を含む上清を捨てます。

次に、ペレット化したメンブレンおよびメンブレンタンパク質を、回転プラットフォーム上で摂氏4度で1時間緩衝液に再懸濁し、可溶化します。その後、再溶解した膜画分を摂氏4度で16, 000Gで1時間遠心分離します。上清を30〜50マイクロリットルのRho1D4抗体ビーズとブランク免疫グロブリンG抗体ビーズと2つの別々の独立したサンプルに混合し、回転プラットホーム上で摂氏4度で1時間インキュベートします。

マグネットスタンドを使用して、ビーズを集めてプルダウンを分離します。上清を捨て、ビストリスプロパン、塩化ナトリウム、およびN-ドデシル-ベータ-D-マルトシドを含む高塩および低塩緩衝液でビーズを洗浄します。ロドプシンタンパク質を溶出するには、ビーズを室温で5〜10分間、所定の組成物の65マイクロリットル緩衝液とインキュベートします。

次に、開口数が 2 mm、光路長が 10 mm の長方形のサブマイクロ 50 マイクロリットル石英キュビットを使用して、分光光度計を使用した高速スキャン設定で 200 ナノメートルから 800 ナノメートルまでの溶出液の吸光度を分析します。品質を検証して判断するには、溶出液を明るい光に1分間さらします。その後、吸光度測定を繰り返します。

ブランク吸光度を差し引き、分析された吸収性スペクトルの比率を計算します。次に、空白から減算された吸収性スペクトルをプロットし、遊離オプシン値を計算します。その後、ランベルトベールの法則を使用して、ロドプシンの濃度を計算し、次にリガンドフリーオプシンの濃度を計算し、アポオプシンとリガンドフリーオプシンの濃度の差を量とパーセンテージで推定します。