腸細胞単分子膜の産生と炎症性サイトカインおよびグリア産物に対するそれらの応答のためのウマオルガノイド培養

まず、トランズウェルインサートを42マイクロリットルの0.05%マトリゲルでコーティングします。摂氏37度で1時間インキュベートし、マトリゲルを硬化させます。余分な培地を吸引し、蓋をせずにトランズウェルを30分間乾燥させます。

次に、各インサートに200マイクロリットルのDMEMF12ミウムを追加し、使用するまで摂氏37度で保管します。オルガノイドを含むマトリゲルパテをPBSで洗浄します。氷上で500マイクロリットルの細胞回収にさらし、混合物を繰り返しピペットで動かして、15ミリリットルのチューブに細胞が完全に集まるようにします。

次に、チューブを300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を取り除き、腸管上皮幹細胞またはIESC培地の目標体積に細胞ペレットを再懸濁します。次に、1ミリリットルのシリンジをIESC培地にプレコートし、16ゲージの針で細胞懸濁液を吸引します。

次に、16ゲージの針を28ゲージの針に交換し、懸濁液を排出してオルガノイドの分離を促進します。次に、得られた細胞懸濁液の200マイクロリットルをコーティングされたトランズウェルの頂端側に配置します。500マイクロリットルのIESC培地および成長因子を基底側に加えます。

二重電極TEER測定チャンバーを使用して、単層全体のTEERを定量化します。カルチャーカップに1.5ミリリットルのIESC培地を入れ、トランズウェルインサートに正確に200マイクロリットルの培地が存在することを確認して、測定中に液面が一致するようにします。トランズウェルインサートの基底外側を、インターロイキン-1ベータの炎症性サイトカインまたはインターロイキン-1ベータに曝露した培養物からのグリア産物に曝露します。

10〜15分ごとに45分間、各トランズウェルを培養カップに入れてTEERを測定します。10ナノグラムおよび25ナノグラムのインターロイキン-1ベータで処理したグリア培養物の培地への基底外側曝露は、上皮バリア透過性を有意に増加させた。さまざまな濃度でウマのインターロイキン-6に曝露した後、上皮透過性の有意な増加は観察されませんでした。.