まず、24ウェルプレートをコーティング溶液でコーティングし、摂氏37度で2時間、または室温で一晩インキュベートします。プレートを滅菌水で2回洗浄し、細胞がプレーティングの準備ができるまで室温で保存します。次に、馬の空腸の一部を取り、氷の上の冷たいリンガー溶液に入れます。
空腸から10センチの部分を切除し、抗腸間膜境界で開き、非リンパ領域を中央に配置します。次に、その部分を約7 x 7 cmのセクションにトリミングし、解剖する前に新しいリンガー溶液で組織をよくすすいでください。次に、シリコンエラストマーでコーティングされたペトリ皿に組織をコールドリンガー溶液(PBS)で固定し、粘膜側を上にして、できるだけ伸ばします。
湾曲した鉗子を使用して、腸絨毛を切除し、次に約5 x 5センチメートルの非リンパ領域から固有層層を切除します。次に、マイクロダイセクションハサミで、1枚のシートの粘膜下組織を1つの角で空けて取り除きます。内側の円形筋層から粘膜下層を剥がしながら自然な分離を観察します。
次に、収集した粘膜下層を2〜5ミリメートルの小片にミンチします。それらを50ミリリットルの円錐管に入れ、FBS、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、BSAを含まない5ミリリットルのオルゴノを入れます。酵素消化のために、組織を摂氏37度で2〜3時間インキュベートします。
インキュベーション後、室温のオルゴノ10ミリリットルをFBSで加えて酵素の作用を止めます。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織混合物を15回上下にピペットで動かし、細胞を組織から解離させます。次に、混合物を3000 Gで室温で3分間遠心分離します。
その後、上清を捨て、10ミリリットルの血清ピペットで溶液を15回上下にピペッティングすることにより、ペレットを10ミリリットルの室温PBSに再懸濁します。コニカルチューブを3000Gで室温で3分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを室温のオルゴノ10ミリリットルにFBSで15回ピペッティングして再懸濁します。
次に、100マイクロメートル、70マイクロメートル、および40マイクロメートルの細孔サイズのセルストレーナーを介して細胞を順次ろ過します。細胞を遠心分離し、上清を廃棄した後、ペレットをFBSを含むオルゴノ1ミリリットルに再懸濁します。次に、細胞をトリパンブルーで染色して生細胞を同定し、血球計算盤を使用してカウントします。
次に、24ウェルプレートの各ウェルにFBSを含む300マイクロリットルのオルゴノに約400,000個の細胞を播種します。各ウェルに5マイクロリットルのN2、5マイクロリットルのG5、および10マイクロリットルのB27を追加します。プレートを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに入れて、細胞接着を可能にします。
最初の継代からの細胞が70〜80%のコンフルエンスに達したら、ウェルをゼロ、10、および25ナノグラムのインターロイキン-1ベータに24時間さらします。腸管グリア形態と一致する紡錘形の細胞が培養物で観察され、多型性があり、他の細胞タイプからの汚染が最小限に抑えられていました。
