レジスタントスターチを豊富に含むイネ品種を選択するためのトランスジェニック植物のジェノタイピングと種子の収穫

まず、SG RNAを取得し、血漿DNAでアグロバクテリウムを形質転換します。トランスジェニック植物を鉢に移植し、温室で1ヶ月間育てます。突然変異タイプをアッセイするには、確立されたプロトコルを使用して、単一の苗の各分げつから2〜3ミリグラムの新鮮な葉を単一のサンプルとして収集します。

採取した葉のサンプルからゲノムDNAを抽出します。シングルガイドRNA標的部位の周囲のSBEIIb遺伝子領域を増幅して、493塩基対の長長増幅フラグメントを得るためのPCRプライマーを設計します。サンガー法を使用してPCRフラグメントを直接シーケンシングし、変異を同定します。

ホモ接合型フレームシフト変異を示すE0系統を選択し、温室に植えて種子を得ます。次に、生後2週間の苗から葉を収穫し、植物のゲノムDNAを抽出します。適切なプログラムを使用してゲノムPCRを実施し、植物ゲノム中のハイグロマイシン、UBI、およびCascosetの存在を検出します。

ゲル電気泳動を使用してPCR産物を解析し、バンドが見られないラインを同定し、それらが導入遺伝子フリーのE1ラインであることを示します。これらの選択した系統から種子を収穫します。突然変異植物は、野生型の穀物の半透明の外観とは異なり、その穀物に完全に不透明なワックス状の外観を示しました。

SBEIIb変異体と野生型植物との間には、種子の設定速度、穂あたりの粒数、および植物あたりの収量に関して有意差は観察されませんでした。