マイクロウェル技術を用いたヒト血管オルガノイドの一貫した生成

まず、50ミリリットルのチューブを氷の上に置き、コラーゲン1つの溶液を他の成分と一緒に順番に加えます。チューブを振ってよく混ぜます。P10ピペットを使用して、混合溶液を振とうしながらモル水酸化ナトリウム溶液を1モルずつ滴下し、pHを7.3に調整します。

5ミリリットルのコラーゲン1混合物に1.25ミリリットルの基底膜マトリックスを加え、溶液を穏やかに混合します。次に、12ウェルプレートを氷の上に2分間置きます。ワイドボアチップを使用して、コラーゲン1基底膜マトリックス混合物を12ウェルプレートにゆっくりと加えます。

12ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間置き、ヒドロゲルの最初の層を固めます。残りのコラーゲンは、後で使用するために、1つの基底膜マトリックス混合物を氷の上に置いておきます。次に、約60個の細胞凝集体を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

そして、チューブを氷の上で5分間冷却します。P200ピペットチップを使用して、チューブから培地を慎重に取り出します。1.5ミリリットルのコラーゲン1基底膜混合物を細胞凝集体に滴下し、広口径P200ピペットチップを使用してそれらを穏やかに混合して再懸濁します。

ハイドロゲルの最初の層が入ったプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。硬化したヒドロゲル層に1.5ミリリットルの骨材懸濁液を加え、プレートを静かに振って骨材を均等に分散させます。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と2時間インキュベートします。

37°Cの水浴中で20分間、予熱血管分化培地2。各ウェルに2ミリリットルの培地を加え、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で培養します。新鮮な温めた血管分化培地2で3日ごとに培地を交換します。

オルガノイドはCD31、ERG1、およびPDGFRベータを発現し、血管内皮細胞と寄生虫の存在を示しています。血管ネットワークは、組織透明化後にホールマウント免疫蛍光顕微鏡で可視化しました。17日目に染色した成熟オルガノイドは、ゲルブロック内にスフェロイドをカプセル化する血管ネットワークを示しました。

28日目に回収されたオルガノイドは、放射状に拡大するのではなく、スフェロイドを包み込む血管ネットワークを持っていました。