この新しいプロトコルは、研究者が細胞内およびミトコンドリアの酸素化だけでなく、サイトソリック酸化還元の状態を含む複数の代謝パラメータを監視することを可能にする。同時に心筋機能の従来の測定を測定しながら。この技術の主な利点は、反射分光法に関連するアーチファクトを回避する穿ファド心臓におけるミトコンドリア代謝の重要な要素の単純な非破壊動的モニタリングである。
この技術に新しいものは、バルブを損傷することなくカテーテルを挿入することに苦労し、部屋の光の汚染を避ける可能性があります。カテーテルは慎重に挿入し、調整する必要があります。また、回収繊維は、難しい可能性がある左心室自由壁を透過する光を最大化するために適切に配置する必要があります。
左心房付属物の小片を切断し、僧帽弁を介して左心室に光ファイバーカテーテルを挿入する。その後、照明付き左心室フリー壁を達成するためにそれを回転させます。ピックアップファイバのもう一方の端を高速走査型分光器に接続します。
ピックアップ光ファイバーは、心臓から約1センチメートルの左心室の最大照明の領域の真向かいに配置します。部屋の光源は 0 にする必要があります。ピックアップ光ファイバのカテーテルの回転と位置は、検出器の飽和を伴わない適切な光を得るために調整する必要があります。
実験領域の照明を消して、完全な暗闇を得ます。分光計ドライバを組み込んだカスタムプログラムを起動し、送信光のデータ取得とリアルタイム分析を実行します。すべてのプロンプトをナビゲートし、浸透した心臓分光法取得モードのオプションを選択します。
次のページで、補助データ収集が行われているかどうかを示します。最後に、クロモフォア参照スペクトルと保存するデータの両方の位置を含む取得パラメータを入力します。490~630ナノメートルの帯域幅を入力します。
2 つのヘルツのサンプリング レートを入力します。暗電流またはゼロの光スペクトルを収集し、光源をオフにしてバックグラウンド信号レベルを補正します。クリックして、継ぎ手ルーチンで使用する希望のクロモフォア参照を選択します。
取得データページでは、カテーテルとピックアップファイバの両方の位置を調整して、酸素化されたミオグロビン吸光度が観察されるべき500ナノメートル領域の信号振幅に特に注意を払ってソフトウェアに表示される透過光を最大化します。透過光が600ナノメートル領域の検出器を飽和していないことを確認してください。カテーテル照明をオフにして、光が検出されていないことを確認して、収集されたスペクトルに貢献する外部光源がないことを確認します。
[スペクトラを保存]ボタンをクリックして、データ収集を開始します。現在の制御スペクトルに対する将来のスペクトルからの差吸光度スペクトルを表示するには、[コントロールとして設定]をクリックします。この時点で、任意の生理的摂動を所望に従って行う。
例えば、シアニジンが心臓の性能および発泡吸収に及ぼす影響を決定するために、シアン化物のリサイクルを避けるためにパーフューズ動物の再循環を停止する。注射器ポンプを使用して大動脈カヌラの直前に異なる速度でシアン化物をパーフューズ動物に注入し、心臓に流入するパーフューズ動物中のシアン化物の所望の濃度を達成する。同時に心機能および光学的特性を監視する。
冠状流量と心拍数の影響と心臓壁を通る光透過が安定した状態にある場合は、シアン化注射器ポンプを停止します。シアン化物注入を停止した5分後、バブリングガスを100%酸素から100%窒素に切り替え、システムから酸素を除去する。約10分後に、全虚血性および低酸素状態をシミュレートするために流れを停止する。
スペクトルデータ分析のために、プログラムをパーフューズド心臓分析モードで実行します。適切な分析プログラムを選択します。データ ファイルのパスと参照スペクトル ファイルを入力します。
カテーテル光源の事前保存されたスペクトルをロードするカテーテル光源を選択します。[ビン データの読み取り] を選択します。次に、[最小波長と最大波長を設定] を選択します。
データ分析の帯域幅を 490 ~ 630 ナノメートルとして入力します。[メイン メニューに戻る] を選択し、[参照の読み取り] を選択します。解析で使用する参照スペクトルを確認します。
メインメニューに戻るを選択し、メインメニューで[時間ポイント]を選択します。ここで、タイム ゼロのタイム ポイントをコントロールとして選択し、範囲を 100 ポイントに設定します。また、100点の範囲で実験期間として時間1つの時間ポイントを選択する。
[平均吸光度スペクトル]タブで生の差スペクトルを確認します。メインメニューに戻り、[差の吸収を計算]を選択します。
時間ゼロと時間 0 と時間 1 の差をすべての位置で選択します。異なるスペクトルウィンドウで適合スペクトルを観察し、参照ウェイトウィンドウでフィット要素を観察します。実験の他の時間ポイントを比較するには、この手順を繰り返します。
メインメニューに戻ります。必要な名前を入力し、他のプログラムで分析するためにデータを保存を選択して、データと分析をスプレッドシートレポートに保存します。ここに示されているのは、ウサギの心臓の壁からの透過光のカテーテルのスペクトルと生スペクトルである。
これらのデータは、スペクトルの青い領域における光の非常に大きな減衰を明らかにします。しかし、ミオグロビンとミトコンドリアシトクロムからの吸光度のバンドは、インサート内で490〜580ナノメートルの間で直接観察することができる。対照とシアン化物処理心臓の差スペクトルをここに示す。
適合スペクトルは、基準スペクトルから計算されます。残差スペクトルは、生データからの適合の減算です。ここに示されているのは、参照スペクトルのスペクトル振幅です。
シトクロム鎖下の電子の流れが安定状態でシアン化物によってブロックされると、ほとんどのシトクロムの吸光度の強い増加が観察される。また、シアン化物により酸素の消費がなくなるにつれて、酸素化ミオグロビンの吸光度が増加した。シアン化物洗浄とシアン化物注入の違いスペクトルは、シアン化物効果の部分的な反転を明らかにする。
ここに示されているのは、非流動虚血状態対対照のスペクトルの違いである。このスペクトルは、細胞球菌の完全脱酸素および減少状態を制御条件で表す。現在、一酸化窒素が心臓代謝に及ぼす影響について研究を進めている。
前述のクロモフォアに加えて、一酸化窒素によって生成されたメトミオグロビンを含む他の光学的に検出可能な種を追跡することもできる。さらに、カテーテルは、レーマン分光法を用いて脂質代謝を研究するためにレーザーに接続することができる。心臓代謝カルシウムは、外因的または遺伝的に組み込まれたカルシウムプローブの吸収によっても研究することができる。
