この作品は、NIH（MWケイにR01-HL095828）からの助成金によってサポートされていました。

1。研究のための設定<ol><li> 118のNaCl、3.30のKCl、2.00のCaCl 2、1.20 MgSO 4で 、24.0のNaHCO 3、1.20 KH 2 PO 4、25.4グルコース、2.00 NaPyruvate、アルブミン20.0 mg / Lで：修正クレブス-ヘンゼライト溶液16（mMでの4リットルを準備します。 。）解決策は、可能な限り実験の開始近くに準備する必要があります。 pHは滅菌フィルター（22ミクロン、コーニングの細孔径）の後に7.4に調整する必要があります。溶液の浸透圧は275および295浸透圧/ kgの間でなければなりません。 </li><li>精製水での作業心臓システムのすべてのチューブとチャンバーを洗浄します。すべての水がシステムから削除されるまでポンプを実行します。 </li><li>灌流ポンプ（ランゲンドルフ灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、右心灌流ポンプ）の各々の行：セルロースメンブレンフィルター（5μmの、アドバンテックの細孔径）を追加します。 </li><li>各圧力センサの2点キャリブレーション（0〜60 mmHg）を実行します。 </li><li>水浴をオンにします。温水循環水浴（コールパーマー）は、水ジャケット管と熱交換器を温めるために使用されます。灌流液は、別の水浴（Oaktonインスツルメンツ）にあらかじめ温めています。両方のお風呂は37℃の液温を維持するために設定されています</li><li>閉ループでの灌流を循環させるポンプの電源をオンにします。灌流液は、80 kPaの少なくとも95％O 2および5％CO 2でガスのマイクロファイバー人工肺（hemofilters）を通過する。酸素灌流は、心臓のカニューレに入る前に37℃の温度で、それを維持するために熱交換器を通って流れる。 </li></ol> 2。心臓の切除<ol><li>一定の圧力ランゲンドルフモードで動作するように働く心臓システムを設定することによって開始します。 50から60 mmHgの範囲内で大動脈ブロックの圧力を設定します。 </li><li>ケタミン（44 mg / kg）及びキシラジン（10 mg / kg）の筋肉内注射でウサギを麻酔。ウサギ（50ミリグラム/ K、鎮静した後にペントバルビタールg）とヘパリン（2000 U）を静脈内後肢の内側の縁耳静脈または外側伏在静脈を介して注入されています。 </li><li>ウサギが完全に応答しない、痛み反射の欠如によって決定されるように、胸腔が迅速に開かれている場合、心がスライスされ、大動脈をクランプされ、心臓と肺を摘出されています。この時点で肺は肺静脈を隔離を支援するために心臓に接続されたままにしてください。 </li><li> 60mLの灌流液とヘパリンの200ユニットで満たされた注射器に接続されている直径5 mmカニューレと大動脈を分離し、カニューレを挿入。サイズがゼロ絹縫合糸でカニューレを大動脈を確保し、徐々に血の心臓をフラッシュするためのシリンジを押す。 </li></ol> 3。両心室カニューレ<ol><li>ワーキングハートシステムの大動脈ブロックに心を接続します。冠動脈塞栓を引き起こす可能性が大動脈を入力してから空気を防ぐことができます。大動脈BLにカニューレを添付することをお勧めです。斜めの角度で大動脈コネクタに近づいており、それが接続されている間灌流液を穏やかにカニューレにコネクターから滴下できるようにすることで、OCK。 </li><li>心臓が一定の圧力ランゲンドルフモードで灌流されていますが、脂肪と結合組織を除去し、次の船探します。劣ると上大静脈、奇静脈、肺動脈、肺静脈を。 </li><li>上大静脈を連結。ここで、右と左肺動脈に分岐のすぐ下に肺動脈を切った。 </li><li>グループ心臓と肺と1縫合糸を使用してそれらすべてを連結の間に残りのすべての血管（肺静脈）。肺を削除します。 </li><li>左心耳の隅にある小さな穴をカットします。 LAは、灌流液で満たされていることを確認してください。それが挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認しながらLAをカニューレを挿入。 LAの付属物にカニューレを縫合。 </li><li> tにフローを提供するために、左側のポンプ（ポンプ＃2）をオンにする彼はアトリウムを残しました。 6 mmHgと調整±2 mmHgで、よ​​うに心房拡張によって決定される - 2の間に予圧圧力を設定します。 </li><li>ランゲンドルフポンプ（ポンプ＃1）をオフにすることで、仕事中心モードに心を切り替えます。 </li><li>一時的に10 mmHgに大動脈圧を低下させ、その後徐々に80から100 mmHgの範囲内にそれを増加させます。これは、大動脈弁が開き、それが正常な生理的条件下で同じように機能するようになります。最終的な後負荷圧がLVの収縮に依存します。それはピークLV圧よりも約20 mmHgの小さい値に設定する必要があります。 </li><li> LV心臓の出力は、大動脈ブロック（mL /分）を終了する灌流液の流量を測定することによって決定することができます。正常な心拍出量は、体重17と平均の100グラム2.2キロのウサギ340 mL /分当たり14.77の間と16.43 mL / minである。大動脈圧は、 図1に示す圧力信号のようになります。 </li><li>私を介してRAをカニューレを挿入nferior下大静脈。 RAとカニューレの両方が完全に灌流液で満たされていることを確認し、気泡の形成を防止しながら、カニューレを挿入します。静脈にカニューレを縫合。 </li><li>右心房への流れを提供するために右側のポンプ（ポンプ＃3）をオンにします。約3 mmHgの圧力を設定します。 </li><li> RVは、灌流液で満たされていることを確認し、肺動脈のカニューレを挿入。それは空気の泡を防ぐために挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認してください。肺動脈にカニューレを縫合。 </li></ol> 4。信号集録：プレッシャー、単相性活動電位、およびfNADH <ol><li>心室カニュレーションが完了したら、慎重に大動脈カニューレを介して大動脈への圧トランスデューサーカテーテル（ミラー）を挿入します。静かに大動脈弁を通過し、LVにそれを移動します。カテーテル先端の適切なポジショニングを確保するため、LV圧力信号を監視します。 LV圧の例が示されている図1に示します。 </li><li>優しく心室心外膜に対する単相性活動電位電極を押してください。適切な行動の潜在的な測定を実現するための信号を監視します。信号のわずかなモーションアーチファクトは正常です。 </li><li>心臓のペースに右心房に双極刺激電極を配置します。私たちのプロトコルでは、心はそれぞれ200および400 BPMに対応し、300と150ミリ秒の間にサイクル長でペースだった。 </li><li> LV心外膜表面の温度を測定します。研究では、温度が37℃に維持する必要がある場合°C、次いで水ジャケット心腔または水没の心を通して一定温度を維持するために温めておいたsuperfusate浴で心の中心に配置します。 </li><li> CCDカメラ（アンドールIXON DV860、128x128ピクセル）を配置し、ビューの適切なフィールドが観察されるようにレンズの焦点を合わせる。カメラは、ワークステーションに接続され、画像がアンドールSOLIS softwaを使用して、2 fpsで取得される再。 </li><li>前の画像の開始に水銀ランプの光をオンにします。光は励起フィルター（350±25 nmであり、クロマテクノロジー）を介して、心臓の表面を照らすために光ファイバライトガイド（堀場ジョバンイボンモデル1950-1M）に指示されています。ライトガイドを介してUV光の減衰は小さい。 UV照明にもLEDスポットライト（MightexのPLS-0365-030-S）と制御ユニット（Mightex SLC-SA04-US）から構成されるハイパワーLEDシステムを使用して提供することができます。 </li><li>部屋のライトをオフにして、任意の周囲の照明を最小限に抑えることができます。均一な心外膜照明を達成するために、心臓部で光導波路（またはLEDスポットライト）のフェルールを目指しています。放出されるNADH蛍光（fNADH）は、発光フィルター（460±20 nmのクロマテクノロジー）を通過してCCDカメラで撮像される。 </li><li>イメージングソフトウェアを使用して、関心領域を選択することにより、時間の経過とともにfNADHの​​変更を監視します。地域O内の平均ピクセル強度を監視するために生きる - 更新モードを選択します。F関心。 </li><li>心臓は、適切な圧力を生成するために心室の動作モードで機能する必要があります。 fNADHレベルが十分な冠灌流を確認するために、心外膜面上の低く安定しなければなりません。研究ではこの時点で、特定の実験プロトコルは、仮説をテストするために実装する必要があります。 </li><li>調査が完了すると、システムから心臓を削除し、すべての灌流液を排出する。精製水を使用してシステムのチューブとチャンバーを洗浄します。日常のメンテナンスは、システムは定期的にMucasol溶液または必要に応じて希釈した過酸化水素溶液でリンスする必要があります。 </li></ol> 5。 fNADH画像のオフライン処理<ol><li> NADHのデータセットを比較する一つの方法（fNADHの（i、j、t））は実験の間には、参照画像を使用して、それぞれの蛍光画像を正規化することであるとして、以下の式に示すように、データセットの9時から（fNADH（I、J、T 0））、 。 NADH蛍光を正規化する別の方法では、PLすることですエース実験9、18、19前に視野内のウラニルガラスの小片。安定した基準として使用することができます信号を提供するために、UV光を照射 - ウラニルガラスは蛍光（550 nmの450）でしょう。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6。代表的な結果両心室作業ウサギの心臓の準備の前方および基底ビューは図1に示されています。左心室圧が大動脈弁を通過し、左心室に圧力トランスデューサーカテーテル（ミラーSPR-407）をナビゲートして測定した。大動脈、肺動脈、左心室圧（LVP）は、 図1Cに示されています。拡張LVPは通常0〜10 mmHgである。最小拡張期大動脈圧は約60 mmHgである。ピーク収縮LVPは、充填圧力（予圧またはLA圧）と収縮性に依存していますと、最適に、80〜100 mmHgのでなければなりません。 図1Cに示すように最大の大動脈圧と最大LVPは密接に一致させる必要があります。 ウサギの心臓のための典型的な高速の脱分極相および再分極相と単相性活動電位（MAP）を図1Dに示されています。 図1Dに示すように、MAPは、請負中心部から比較的容易に記録することができますが、通常は拡張期の間に小さなモーションアーチファクトがあります。 MAPはペーシング中の心臓（キャプチャ）が正常に同調を確認するために有用であり、また、虚血または他の急性摂動のために地元の電気生理学的変化を測定するために使用することができます。 ECGは、暖かいsuperfusateのお風呂で心を沈めると、心臓の左と右の両側にお風呂に電極を配置して測定することができます。第三不関電極のいずれか心臓から、浴中に置かれているか、または大動脈に取り付けられています。ECGは、全体の電気的機能を評価するため、虚血の存在を明らかにするために有用であるグローバルな励起及び再分極過程に関する情報を提供していきます。 fNADHイメージングは​​、虚血や低酸素領域の時空間的進行を測定するために使用することができる心臓のミトコンドリア酸化還元状態の変化を明らかにする。この研究では、心外膜fNADHはサイクル300の長さ（CLS）、200、150ミリ秒の3つのペーシングレートの間に酸化還元状態の変化を監視するために測定した。関心領域（赤いボックスは、 図2）から平均fNADH値は、サイクルの長さが短くされているベースラインfNADHレベルが増加することを示している。速度をペーシングするときはベースラインfNADHレベルが比較的一定である洞調律（CL = 300ミリ秒）に近いです。サイクルの長さとして最短CL（150ミリ秒）で最大の増加に伴って300ミリ秒、ベースラインfNADHレベルが増加し、下に短縮されます。完全な前面の高分解能イメージングfNADH200と400でBPMを図3に示します。 200 BPMでfNADHレベルは一定で、空間的に均質であった。 400 BPM、fNADHレベルは心外膜を通じて大幅に増加した。重要な空間的な異質性がRVとLVの中隔の領域内で発生する最大の増加が観察された。 fNADH信号が収縮（モーションアーチファクト）で発振し、発振の周波数は、心拍数（ 図2）に対応しています。心室カニュレーションでは、心臓のベースは、収縮時の揺れから心臓を防ぐことができます4カニューレにより保持されます。したがって、発振振幅は任意の長い時間スケール（5-10秒）虚血あるいは低酸素状態によって引き起こされるfNADHの​​動向よりも常に少なくなります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> 図1。孤立した両心室からの典型的な圧力と単相性活動電位は、RAの作業心をBBIT。左心房3; 1、大動脈、2、肺動脈、4、右心房、左心室（LV）と右心室を示し、心臓のB.前方ビュー：A.基礎4カニューレを示す心のビュー。 （RV）。C.代表圧力。上：左心室圧（実線）と大動脈圧（点線）。底部：肺動脈圧D.描写単相性活動電位。信号は、パネルCに示される圧力に揃えて配置され<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> 図2。ウサギの心臓の作業分離された両心室のfNADHイメージング。トップ：視野の漫画（左）と3つのfNADH画像が表示されます。対応するペーシング周期長（CL）は、各画像に表示されています。下部のパネルにfNADH信号の関心領域は、赤いボックスで示されます。単相性活動電位電極の先端は、関心領域の右側に見られている。心外膜は、 図5に示すように、水銀ランプとライトガイドを使用して点灯されました。唯一の関心領域を取り巻く心外膜面が点灯されたボトム：関心領域の平均fNADHトップパネルの赤いボックスで示されます。縮小周期の長さの平均fNADH増加します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> 図3。ウサギの心臓の作業分離された心室の完全な前面のfNADH画像。心臓は200拍、400拍で、RAからのペースだった。 2つの高電力のLED（Mightex PLS-0365-030-S、365nmの4％を使用して、全体の前心外膜を照らしながらfNADH（2コマ、0.4ミリメートルの解像度で128×128ピクセル）画像化したIntensity、50 mW（最大））。

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A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

孤立したランゲンドルフ灌流心臓は心臓の生理学2を研究するための著名なツールのままです。それは、特に不整脈、膜電位20の蛍光イメージングを使用するものの研究に特に有用である。利点は、単離された心臓の心外膜全体が21日、22日を観察することができることである。もう一つの利点は、血液とは対照的に、明確な晶質緩衝液による灌流が蛍光信号と干渉しないということです。制限は、ランゲンドルフ技術が頻繁に心臓が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していないということです。 代謝研究のために孤立した心の準備、適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力3を確立するために、ランゲンドルフ技術にニーリィ導入された変更の妥当性を高めるために。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝4-6を研究するために広く使用されています。 LVの作業心臓モデルは、機能評価のためのランゲンドルフモデル​​よりも優れている、まだそれは正しくロー​​ドされ、右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル7、8の変形例として心室モデル（LV＆RV）を報告しました。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード8にLVモードでの作業から変換された心の中で改善されました。正しくロー​​ドRVはまた、隔壁全体に異常な圧力勾配を減少させることにより中隔機能を向上させます。両心室の心の作 ​​業は、最大3時間〜8のために大動脈出力、肺血流量、平均大動脈圧、肺動脈圧、心拍数や心筋ATPを意味し、クレアチンリン酸レベルを維持することが示されている。両心室仕事心臓の研究は、一般的に心のFRを使用しこのようなラットやウサギなどの小動物OM、心拍出量と灌流液の必要量は大型動物の心のそれよりもはるかに少ないためです。しかし、両心室仕事心臓の研究は、ブタ、イヌ、さらには人間の23日、24日から心を用いて実施されています。 両心室の動作モードで分離された心臓の代謝需要がランゲンドルフ灌流のそれよりかなり高くなっています。それは灌流溶液は両心室の心機能をサポートするのに十分な酸素や代謝基質を提供することが重要です。このようなクレブス-ヘンゼライト16、17、25またはタイロード26、27などの標準的な晶質緩衝液は、5.6 mg / Lで同じ高さの酸素溶解性を有するこれらのソリューションはcarbogen（95％O 2および5％CO 2ガスのブレンド）をガス処刑し、適切な代謝基質（グルコース、デキストロース、および/ ​​またはピルビン酸ナトリウム）が含まれている場合、それらは標準で打つ心室仕事の心に適していますら洞レート（ウサギのために約180 BPM）。 速いリズムの代謝需要が増加し、標準灌流液中の溶存酸素量が十分に高い率で縮小している両心室仕事心臓をサポートするのに十分ではないかもしれません。赤血球または全血との混合を含む晶質緩衝液は、十分な酸素の可用性を確保するために働く心の準備に使用されている。これまでの研究では、クレブス-ヘンゼライト溶液に赤血球を追加すると厳格なペーシング·プロトコルの間に働く心機能を改善し、また心室細動16の発生率を減少させることが示されている。全血の赤血球またはその混合物を使用することの制限は、ヘモグロビンが蛍光イメージング13に使用されている光の波長と干渉です。アルブミンのような他の基質は、また、心臓の生存を延長し、浮腫28を削減するソリューションを潅流液に添加することができる。 蛍光イメージングの間に励起光の強度が高くなければならず、光の分布は均一でなければなりません。均一な照明を実現するには、常に心外膜面の曲率に起因する簡単ではありません。水銀ランプからの光（350±25 nm）をフィルタリングすることにより、我々の研究で、我々のイメージfNADH。分岐光ファイバライトガイドは、心外膜の表面にUV光を導くために使用されます。均一な照明は、適切なポジショニングつの出力のフェルールによって達成することができる。 UVは、我々は、 図3に示されているように光源も、使用することができるLEDが点灯します。 LEDの源は、比較的安価であるため、複数の情報源は、イメージングシステムに組み込まれる可能性があります。 LEDは、画像取得と励起光を同期させるために高いレートでオンとオフを循環することができます。 NADHの光退色は組織照明の時間を短縮することで29最小限に抑える必要があります。これは上の照明を入れ直すことによって、電子を使用してオフに行うことができますICシャッターとランプやLED照明システムとコントローラである。照明が心周期と同期されている場合は、fNADH画像取得は、蛍光シグナルにおけるモーションアーチファクトを減らすことがその、拡張期に限定することができます。そのようなLV圧として圧力信号を使用してTrigging照明及び画像取得は、これを行うための一つの方法だろう。 我々の研究では、単位時間当たりfNADHの​​変化が200 BPMで400以上のBPMの5倍以上高くなることがありますことを観察した。これは、高速リズムは心臓のレドックス状態を高めることを示しています。これは、低酸素またはNADにNADHを酸化する筋の無力によって引き起こされているかどうか+ NADHの​​蓄積を避けるために十分な速さは、まだ未解決の問題です。 両心室仕事心の準備のパフォーマンスは、複数の要因によって決まります。最も重要なものの1つは生理を模倣するために適切な負荷および後負荷圧力を設定することです。調査中である条件。特に、左室後負荷（大動脈圧）は、全身の圧力を表すように調整する必要があります。それが高すぎる場合、LVは、逆流、その結果、圧力を克服することはできません。低すぎると圧力が悪影響を冠灌流に影響を与えます。 LVプリロード圧（左心房圧）も、実験プロトコルに適した拡張末期容積を提供するように調整する必要があります。 生体組織のfNADHイメージングは、蛍光イメージング13の確立されたモードです。彼らは冠血管14のライゲーション後、地域的に虚血組織内fNADHの顕著な上昇を報告した心臓組織への応用は、バーロウとチャンスによって示されました。そのfNADH画像はフェアチャイルド·オシロスコープのカメラとUVフラッシュ撮影を使用してフィルムに記録された。 Coremans ら 。 measurにNADH UV /蛍光反射率を使用して、この概念に基づいて拡大電子ランゲンドルフ血液灌流ラット心臓30の心外膜の代謝状態。 videofluorimeterは、イメージングに使用され、データはビデオレコーダーを用いて記録した。その後、ショルツら 。 LVの大面積からの平均fNADHを測定する分光器とフォトダイオードアレイを使用していました。 fNADH 31巨視的な仕事に関連する変動を明らかにしながら、このアプローチは、心外膜の蛍光不均一性と循環の局所変動の影響を減少させた。 図2に示すように、このアプローチは、fNADH画像データセットのすべてのフレームにわたって関心領域のためのコンピューティングの平均fNADHレベルに似ています。我々はこの記事で紹介してきたように、今日の技術は、高速CCDカメラとデジタル制御ハイパワーUVスポットライトを提供します。これらの技術は、fNADHと心臓代謝の時空間ダイナミクスは多くの新たな視点から検討することができます。光学系と光源の比較的低コストはfになりますNADHイメージング、従来の心臓の光マッピングシステムのための有用な付属品9、32

<table border="1"><tbody><tr><td> 化学物質 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4で </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> 423から316 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td>アルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

ランゲンドルフを1つの創業以来、単離された灌流心臓は心臓の生理学2を研究するための著名なツールのままです。しかし、それは心が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していません。ニーリィ適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力3を確立するためにランゲンドルフ法への変更を導入しました。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝4-6を研究するために広く使用されています。このモデルは、しかし、適切にロードされた右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル7、8の変形例として両心室モデルを報告した。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード8に働くLVモードから変換された心の中で改善されました</sup&gt;。正しくロー​​ドRVはまた中隔機能を改善するために隔壁を越えて異常な圧力勾配を減少させる。両心室の心の作 ​​業は、最大3時間〜8のために大動脈出力、肺血流量、大動脈圧、心拍数を意味し、心筋のATPレベルを維持することが示されている。 このような虚血など心筋傷害の代謝効果を検討の際には、多くの場合、影響を受けた組織の位置を特定する必要があります。これはイメージングによりNADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）9-11の蛍光を行うことができる、補酵素はミトコンドリアで大量に発見した。 NADH蛍光（fNADH）は、ローカルの酸素濃度12に近い直線的に逆の関係が表示され、ミトコンドリアの酸化還元状態13の尺度を提供しています。低酸素および虚血状態でのfNADHイメージングは低酸素領域14、15を識別するためとの進行を監視するために色素フリーの方法として使用されている時間は10以上、低酸素状態。 メソッドの目的は、筋細胞代謝率を変更したり、低酸素症を誘発するか、または両者の組み合わせを作成するプロトコルの中に心室仕事心のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。ニュージーランド白ウサギの心臓は37℃で両心室仕事心臓システム（ヒューゴサックスElektronik社）に接続され、修正クレブス-ヘンゼライト溶液を16で灌流した大動脈、左心室、肺動脈、左＆右心房圧を記録した。電気的活動は、単相性活動電位電極を用いて測定した。画像fNADHに、水銀ランプからの光は、フィルタ（350±25 nm）と心外膜を照らすために使用されていました。放出される光はフィルタ（460±20 nm）とCCDカメラを用いて画像化した。別のペーシングレートの間に両心室仕事心の心外膜fNADHの​​変化が表示されます。心臓モデルとfNADHイメージングの組み合わせ現実的な生理的条件下の文脈の中で急性心臓の病理学を研究するための新たな価値のある実験的なツールを提供しています。

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

目的は、生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で孤立した心臓のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。両心室作業ウサギの心臓のモデルが提示されます。 NADHの​​高い時空間分解能蛍光イメージングは​​、心外膜の組織のミトコンドリア酸化還元状態を監視するために使用されます。

隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K ビュー.  The George Washington University. 目的は、生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で孤立した心臓のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。両心室作業ウサギの心臓のモデルが提示されます。 NADHの​​高い時空間分解能蛍光イメージングは​​、心外膜の組織のミトコンドリア酸化還元状態を監視するために使用されます。

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Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

医学

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

蛍光共焦点ビデオ顕微鏡を使用して腫瘍血管新生のin vivoイメージング

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart model, have been invaluable tools for studying cardiovascular function and disease1-15. Although the Langendorff heart preparation can be used for any mammalian heart, most studies involving this apparatus use small animal models (e.g., mouse, rat, and rabbit) due to the increased complexity of systems for larger mammals1,3,11. One major difficulty is ensuring a constant coronary perfusion pressure over a range of different heart sizes &#8211; a key component of any experiment utilizing this device1,11. By replacing the classic hydrostatic afterload column with a centrifugal pump, the Langendorff working heart apparatus described below allows for easy adjustment and tight regulation of perfusion pressures, meaning the same set-up can be used for various species or heart sizes. Furthermore, this configuration can also seamlessly switch between constant pressure or constant flow during reperfusion, depending on the user&#8217;s preferences. The open nature of this setup, despite making temperature regulation more difficult than other designs, allows for easy collection of effluent and ventricular pressure-volume data.

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

大型動物モデルの絶縁型ワーキングハートシステム

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

トランスレーショナルがん研究のためのヒト組織での作業

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

生理学的条件下での豚の心臓のスライスと培養

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

ラットの心筋梗塞を誘導する半最小侵襲法と、単離した働く心臓システムによる心機能の評価

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

ウサギモデルにおける孤立した肺灌流システム

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...