著者は、以下の機関が資金援助を認める、国立科学財団（グラント0719232）、エネルギー省（グラントDEFG02 - 01ER15129）、WMケック財団（助成041904）、およびジョージワシントン大学の研究強化基金。著者らは赤外線ファイバーシステム（シルバースプリング、MD）によってだけでなく、マークE.リーブス、ジョージワシントンのジョーンA.ホフマンによって繊維のエッチングに関するプロトコルに関する初期の議論のための寛大に付属のGeO2系光ファイバのために感謝しています大学。また、作者はプロトコルのビデオ撮影中に彼女の助けのためにジェシカA. Stoleeに感謝したいと思います。

1。光学部品<ol><li>レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析（MS）のためのレーザーアブレーションは、2.94μmの波長の5ナノ秒レーザーパルスによって生成されます。ネオジムで駆動される可変光パラメトリック発振器：YAGレーザー（Opolette 100、Opotek社、カールスバッド、カリフォルニア州）はこの研究ではアブレーションのために使用されます。繰返し速度は5〜100 Hzの間で選択されています。これは直接の暴露による眼や皮膚に深刻な永久的な損傷を引き起こす可能性があることをクラスIVのレーザーです。レーザービームの乱反射はまた、皮膚や眼に対して危険です。保護のための適切なレーザーのゴーグルを着用してください。 </li><li>二酸化ゲルマニウムベースのガラス製の光ファイバは、赤外ファイバーシステムズ社（シルバースプリング、MD）から入手した。そこハイトレルであり、繊維のコーティングをポリイミド場合両端からそれらを削除するには、次の指示に従ってください。 ° Cドラフト内で130から150までヒート1 - メチル-2 - ピロリジノン。繊維は、約1分間、またはコーティングの軟化を開始し、剥離するまでこの液体に削除するようにしたい終わる浸します。分のためのメタノールまたはイソプロパノールに軟化コーティングを浸し、糸くずの出ないナプキンと残りのコーティングを拭き取ってください。コー​​ティングを除去した後、切断するスコアリングと優しくして洗浄液を完全にサファイアブレード（KITCOファイバーオプティクス、バージニアビーチ、バージニア州）と光ファイバの両端。 </li><li> 1％（v / v）の硝酸（試薬特級）ソリューションによって、繊維の先端の化学的エッチング一方の端を目的のシャープネスを実現する。垂直に最初の接触後、300〜500μmの深さに酸溶液中に繊維の選択終了を浸す。エッチングの約15分後、先端には、自発的に酸の表面から分離させます。曲率の​​〜15μmの半径を持つ尖った繊維の先端でこの結果。任意の酸残基を除去する脱イオン水ですすいでください。 </li><li>マイクロマニピュレータの光ファイバ（MN - 151、成茂、東京、日本）のエッチング端をマウントし、効率的なエネルギー付与のために細胞表面の近接（〜20μm）を閉じるためにそれをもたらす。 </li><li>ベアファイバチャック（BFC300、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）によって光ファイバの非エッチング端を保持する。光学的アラインメントの場合は、ファイバーチャックは5軸トランスレータ（BFT - 5、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）にマウントされています。レーザーのエネルギー（0.5〜1 MJ）は、その非エッチングエンドに平凸フッ化カルシウムまたは反射防止コーティングのZnSeレンズ（赤外線光学製品、ファーミングデール、ニューヨーク州）でビームを集中させ繊維に結合される。保護された金の鏡（PF10 - 03 - M01、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）は、集光レンズの上に中赤外レーザビームを操縦するために使用されます。 </li></ol> 2。エレクトロスプレーセットアップ<ol><li>導電性パーフロロエラストマーフェラル、フィッティング、チューブスリーブ、ニードルポート（それぞれ例えば、U - 435、M215、F - 331Nx、F - 242x、9013、IDEX健康科学、と金属労働組合：エレクトロスプレーシステムは、次のコンポーネントを使用して構築することができます。オークハーバー、ワシントン州）だけでなく、フューズドシリカチューブ（例えば、CT360 - 100 - 50 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）。推奨エミッタはステンレス鋼製で、50μmのID（例えば、MT320 - 50 - 5 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）とテーパー先端部を有している。 </li><li>エレクトロのための0.1％酢酸（v / v）で50％メタノール溶液を調製。ソリューションを使用して、シリンジポンプ（ハーバード装置、ホリストン、MA）で200〜300 NL / minの速度で励起され、例えば、500μLシリンジ（81222、ハミルトン社、リノ、ネバダ州）。 </li><li>安定したエレクトロスプレーを生成するために安定化電源（PS350、スタンフォードリサーチシステムズ社、カリフォルニア州サニーベール）によって金属の組合に2800と3,000 Vの間に高電圧を印加してください。すべての電気接続が確実、適切に接地されたシールドでシールドしていることを確認してください。露出の高電圧との直接接触は感電の恐れがあります。 </li></ol> 3。サンプル処理<ol><li>適切なソースから生きている組織または細胞のサンプルを入手し、それらを分析する前に推奨してください。このデモ用のタマネギの球根は、ローカルストアから購入した。外科用メスで縦方向に電球をカット。規模の少数のセンチメートルのセグメントは、ストリップに区分した。内側の表皮組織の完全な単分子膜を剥離する。 </li><li>表皮の湿った表面は、事前に洗浄したガラスの顕微鏡スライド上の組織をマウントするために使用されます。位置決め用の三軸移動ステージにマウントされている汎用のプレートホルダー（FP01、Thorlabs社、ニュートン、ニュージャージー州）でスライドをホールド。セルの劣化を防止するためにサンプルをマウントした直後にマススペクトルを取得する。 </li></ol> 4。可視化システム<ol><li>二つの長距離顕微鏡は、分析用のセルを選択すると尖った繊維の先端と細胞表面との間の距離を維持するために使用されています。後者は表面から測定した15 ° -30 °の角度でマウントされています。このシステムは、らで構成されています5倍の無限大とオングの距離のビデオ顕微鏡（7倍精度ズーム光学、エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）は、CCDカメラ（マーリンF131、アライドビジョンテクノロジーを搭載した、対物レンズ（Mプランアポ5倍、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）を修正監視および画像取り込みのための、Stadtroda、ドイツ）。 </li><li>秒のビデオ顕微鏡は、上から細胞を可視化するために試料表面に直角に取り付けられている。このシステムは、アブレーションおよび分析のために選択したセルの上のファイバーの先端を揃えるために視覚的なフィードバックを提供します。それは10倍の無限大を搭載した7倍の精度ズーム光学（エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）から成り、長作動距離対物レンズ（10倍Mプランアポ、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）とCCDカメラを訂正。 </li></ol> 5。マススペクトルの取得<ol><li>レーザー、エレクトロスプレー質量分析計、例えば、四重極飛行時間型システム（Q - TOFプレミア、ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州）をオンにします。アブレーションのスポットやエレクトロ互いに相対的なエミッタと最大イオン強度を達成するために質量分析計のオリフィスの位置を調整することによって、LAESIのイオン源の形状を最適化します。 </li><li>トップビューの可視化システムを使用して分析の対象セルを選択します。選択後、直接光ファイバの先鋭化先端下に選択したセルを持って来るために、サンプルステージを移動します。サイドビュー顕微鏡を使用すると、〜20μmの先端から細胞表面の距離を再調整。 </li><li>エッチングされた光ファイバ先端を介して選択されたセルでの火災のレーザーパルスを。細胞壁と粒子状物質の形で細胞質の放出の穿孔でこの結果。エレクトロスプレーによるpostionizationした後、生成したイオンは質量分析計と質量スペクトルによって収集され記録されます。 </li><li>データ収集後は、レーザー、スタンバイモードのエレクトロと質量分析計を入れたり、それらの電源を切ります。アブレーションA.キープ光顕微鏡によるオプションの観察のためのCEPAの組織サンプル。 </li></ol> 6。代表的な結果細胞壁とLAESIの質量スペクトルのコレクションの崩壊で、単一セルの結果の成功アブレーション。失敗した実験は、通常、無アブレーションおよび/または無質量スペクトルをもたらす。デモンストレーションの目的のために、我々はAの単一の埋め込 ​​まれた表皮細胞のLAESI - MS分析の結果を提示CEPAの電球。図2aは、細胞の採取後の代表的な光学顕微鏡像を示しています。細胞壁は、ミシン目が入っていますし、穿孔の程度は、隣接セルとの境界によって制限されます。隣接する細胞が正常であるように思われる。図2bは、細胞から産生さ代表LAESIの質量スペクトルを示しています。イオンの多種多様なAから検出されCEPAのセルとその正確な質量に基づいて、同位体の分布パターン、及び、いくつかのケースでは、タンデム質量スペクトル、それらは暫定的に内因性代謝物に割り当てられます。単一の細胞から検出されたイオンは、複数のセルの従来のLAESI - MSで同じ組織の分析で観察されたものと類似していた。13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 LAESI - MSによる単一細胞解析の概略図 。中赤外レーザーパルスが光ファイバに結合し、ガラススライド上に配置サンプルに配信されます。尖った繊維の先端は、標的細胞に光を当てて堆積したエネルギーは、セルを爆発。生成されたアブレーションプルーム（赤い点）は液滴が合体するエレクトロスプレープルーム（黒ドット）（緑の点）のサンプル、特定のイオン生成の結果とマージされます。これらのイオンは、質量分析計（MS）により分析し、検出されます。二つの長距離ビデオマイクロスコープ、顕微鏡1、顕微鏡2は、繊維の先端と細胞表面との間の距離を監視し、それぞれ、分析のためのセルを選択するために利用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="図2a" /> A.単一の表皮細胞上図2a。アブレーションマークCEPAの電球。隣接するセルは、目に見える損傷を示していないと、その後別々に分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="図2b" /> シングルAのアブレーションに対応する図2b。質量スペクトルCEPA表皮細胞は一次と二次代謝産物の存在を示しています。

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	<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Mass+Spectrometry.">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li><li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets.">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI.">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics.">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry.">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , (2010).</li><li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses.">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞の細胞質と細胞壁や細胞膜の引張強度の含​​水量はLAESI - MS分析時の単一細胞のアブレーションを支配する重要な要素です。レーザーのフルエンスは、異なる細胞型のアブレーションしきい値に達するように調整する必要があります。納入レーザフルエンスは、レーザーパルスのエネルギーにし、繊維の先端と細胞表面との間の距離に依存する。単一細胞解析の間に隣接するセルの摂動を最小化することが重要です。アブレーションしきい値でレーザーのエネルギーを保つことは、隣接するセルに分析の影響を制限します。 潜在的なアプリケーションの一つは、MSによる化学イメージングのための自然な体積画素（ボクセル）として単一のセルを使用しています。人工しばしば長方形のグリッド上でデータを収集して比較して、一度に組織つのセルの化学イメージングは​​、細胞間の生化学的相互作用の空間的な組織を維持する可能性が高くなります。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

単一細胞内の生化学物質の分析でも同じ種類の細胞がそれらの生理的条件と環境との相互作用に応じて、異種の生化学的メイクを示す細胞の代謝、細胞周期、適応、疾患の状態などを理解する上で重要です。単一細胞内の生体分子の解析に用いる質量分析（MS）の従来の方法には、豊富なサンプル調製に依存しています。彼らの自然環境と豊富なサンプルの処理から細胞を除去する細胞組成の変化につながる可能性があります。周囲のイオン化法は、ネイティブ環境では、広範な試料調製のないサンプルの分析が可能になります。1は 2.94μmの波長の生物学的材料の中間赤外（中赤外）レーザーアブレーションに基づく技術は、水の突然の励起を利用するその段階での結果爆発。このようなレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（LAESI）と大気圧赤外線マトリックス支援レーザー脱離イオン化（AP IR - MALDI）などの中赤外レーザーの照射に基づいて2周囲イオン化技術は、正常に直接水を分析する能力を実証した大気圧下で豊富な組織や体液。LAESI主にイオンを生成するために高度に帯電したエレクトロスプレー液滴と試料の合体から中性の粒子状物質で構成されて中赤外レーザーアブレーションプルーム中の3-11。最近、単一の細胞の中赤外アブレーションは、エッチングされた光ファイバを介して中赤外放射を提供することにより行った。このアブレーションから生成されるプルームはLAESI - MSによる単一細胞の多様な代謝物の分析を可能にするエレクトロスプレーによってpostionizedした。12この記事は、LAESI - MSを用いて単一細胞解析のための詳細なプロトコルを記述している。紹介ビデオは、 タマネギの球の皮膚から単表皮細胞の分析を示しています。システムの概略図を図1に示されています。細胞から単一細胞のアブレーションとLAESIのマススペクトルの代表例を図2に提供されています。

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Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

単一細胞解析は、レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析のために細胞をサンプリングするために削られた光ファイバを使用して、大気圧下で植物や動物の細胞に質量分析法によって行われます。

大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K ビュー.  George Washington University. 単一細胞解析は、レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析のために細胞をサンプリングするために削られた光ファイバを使用して、大気圧下で植物や動物の細胞に質量分析法によって行われます。

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

シングルプローブの応用：周囲条件下での質量分析イメージングと単一細胞解析

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...