我々は、この記事を後援し、多くの技術支援のためのステファンシュワルツとBiobserve GmbHのクリスチャンGutzen恩義があります。私たちは、魚の世話と支援のためオリビアオチョア、キリスト教のカウフマン、およびザカリークレスに感謝、私たちは魚を収集するための権限メキシコ連邦政府に感謝しています。我々は、グレンVigus、フレデリックパーク、テキサスA＆Mでの可視化研究室にお世話になりますアテナメイソンとライアンイースタリングは、この出版を準備するのを支援してくれました。資金は、テキサスA＆M大学とNSF IOS - 1045226で提供されていました。

1。ハードウェアおよびビューアのシステムをセットアップする。 システムは、2つのモニタに挟まれた試験槽で構成されています。 BIOBSERVEビューアのシステムに接続されているビデオカメラはリアルタイムで被写体の動きを記録します。モーションデータは、画面上のアニメーション刺激の動きを判別する別のサーバーに、上のインタラクティブなビデオ再生（IVP）プログラムに渡されます。 <ol><li>きれいな水で満たされた80リットルの水槽の両端に2つのCRTモニター、マッチのモニター出力。 </li><li>オーバーヘッド場所のカメラ水族館の完全なビューをキャプチャするために、ビデオカードをBIOBSERVEに接続する。 </li><li>カメラからの追跡情報を受信するビューアのシステムを構成します。 </li><li>指定されたネットワークのIPアドレスを経由して動物の鼻、ボディ、およびリアルタイムでのアニメーションのサーバへの尾の座標を送信ビューアにプラグインを有効にします。 </li><li>アニメーションのサーバーの電源を入れます。 </li></ol> 2。キャリブレーション。 <ol><li>アニメーションのサーバー上で、InteractiveDisplaySetup.txtを開きます。 &quot;モニター情報&quot;の下のピクセル単位の画面幅と画面の高さを入力します。 &quot;ProgramType&quot;の下に&quot;校正&quot;を入力してください。ファイルへの変更を保存します。 </li><li>プログラムを起動するためにIVPのプログラムアイコンをダブルクリックします。 </li><li>として、ステップ2.3でビューアのシステムで設定されたタンクの大きさのエクステントに入力します。これにより、ビューアのデータとIVPからインタラクティブ出力との対応を保証します。 </li><li>水槽の端部がモニターよりも小さいので、ソフトウェアは、ユーザーがの表示領域（ビューポート）を移動するキーボードを（と高さの幅、zとxの秒、および矢印キーの位置など）を使用することができます試験槽の端に合わせて刺激。アニメーションのサーバ上で閲覧、ピンクのビューポートは1つのテストのモニターや他の上の青色のビューポート（図1）にエコーされます。 </li><li>それが目的の刺激の大きさを一致するまで、両方のビューポート上でオスの魚の表示を拡大縮小するには、キーボード上のzとxを使用してください。 </li><li>彼らは試験水槽の端に合うように、表示されたボックスを移動します。ユーザーは、魚の中心から向かって、または離れてボックスを移動するにはQまたはWキーを使用しています。 </li><li>プログラムで要求されたときに実験の情報を入力してください。ユーザーは、プリロードされたモデル（私たちのデモでは、男性Xiphophorus birchmanni、X. malincheを求愛）の中から選択するオプションがあります。ユーザーはまた、各段階でそれぞれの魚（非対話型またはインタラクティブ）、それぞれの刺激が現れる側、ステージ、および各刺激の所望の大きさ（標準長さ）の動作を指定します。 </li><li>ユーザーは、魚の動きは、水槽の両側に、モデルの動きがまったく同じであることを、ミラーリング、すなわちになりたい場合は、次の質問が尋ねられます。魚アニメーションモードで両方であるときにだけ使用されます。最後の質問は、背びれの動きに関するもの。ユーザは、デフォルトの背側を選択することができますが、これは背だけ横求愛ディスプレイ中に上げてしまいます。背がデフォルトに設定されていない場合、モデルがモニターから被写体の距離に応じて、その背びれが発生した場合、ユーザが決めることができます。 </li></ol> MATE -選択肢のテストのためにIVPを3.Starting。 <ol><li>オープンInteractiveDisplaySetup.txtと設定は&quot;ProgramType&quot;liveTestingと実験データが含まれている同じファイル名に&quot;experimentName&#39;を設定する。 </li><li>ゆっくりと水槽に対象魚を置き、10分を待つ。 </li><li>ビューア2.0とIVPを起動します。 </li></ol> 4。メイト - 選択試験。 全体的な実験的なシーケンスは、非対話型ビデオの刺激1-4を使用して以前の研究に従います。女性は、試験水槽の両端にモニター上の異なる2つの刺激が提示されます。女性の行動はBiobserveビューアのシステムでリアルタイムで追跡されます。応答アッセイは、協会の時間、女性は一方のモニタまたは他の10cm以内に費やす時間の量です。協会の時間が自動的にビューアによって計算されます。 <ol><li>ビデオの刺激は、2つ、20分のステージで構成される試験の被験者に表示されます。ステージは4本の5分間のセグメントで構成されています。 <ol><li>最初のセグメントは、両方のモニタ上に単色画面を表示することにより、5分間の試験槽にメスをacclimatizes。 </li><li>番目のセグメントでは、2つの異なるビデオ刺激が女性、左側のモニタ上に1〜5分は右の他に表示されます。 </li><li>すぐにビデオの刺激の表示に続いて、単色の画面が再び5分間両方のモニタに表示されます。 </li><li> 4番目と最後のセグメントでは、2つ目のセグメントからの刺激が提示されますが、各刺激の位置が切り替えられます。これは、サイドのバイアスのための内、女性のコントロールを提供します。 </li></ol></li><li>秒ONDの段階では、同時に提示刺激の異なるセットを使用して、同じパターンを繰り返す。 </li><li>追加の試験がステップ2に戻り、体系的にプレゼンテーションの側面と順番を変えることによって実行されます。 </li></ol> 5。代表的な結果。 私たちは、男性の求愛のインタラクティブおよび非インタラクティブなアニメーションへの女性の反応を比較することによって、インタラクティブな再生の有効性を評価した。非対話型の刺激は、以前の研究1〜4のように、女性の行動の独立した画面上の求愛の刺激を、行った。 インタラクティブな刺激では、画面を横切る女性の水平方向の位置を追跡した。シミュレートされた魚や対象魚のどちらかの位置は、操作上の重心と鼻を結ぶ線の中点として定義されていました。 ：X方向は、タンクの長さを指し、およびZ方向のタンクの幅（図2）を参照している男性の行動を導く三つのルールは以下のとおりである、 ルール1：シミュレートされた男性は、常にZ方向に彼女を追跡する、画面全体の主題に従います。 ルール2：それは横方向求愛ディスプレイを実行しているときにシミュレートされたオスの背びれにだけ発生します。 ルール3：シミュレートされた男性のソードテールの魚は、それが女性のために表示されている合計時間の50％を横求愛ディスプレイを実行します。横方向の求愛ディスプレイは、Z方向のメスの魚の四分の一男性の体の長さ内にあるオスの魚によってトリガされます。横方向の求愛行動は雌がX方向でモニターにどれだけ近いかとは無関係です。 インタラクティブな刺激は密接にリアルタイムで女性の位置（図3）を追跡。 4,5の非対話型の刺激を使用して前の仕事は、その女性のXを示したbirchmanniが強く、自分の種の視覚信号を好んだ。 IVPで作成された非対話型の刺激は、同種の仲間の設定（T = 1.923、N = 9、P = 0.046）を誘発することで同様に効果的であった。女性がシミュレートされた対話型の同種および異種男性でテストされたときにすぐに前または後に同じ試験で、しかし、彼らは好み（図4）を示すことはできなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig1.jpg" alt="図1" /> 図1キャリブレーション用のセットアップを監視します。 <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。タンクとモニターのセットアップの模式図は、位置を記述するために使用される軸を示す。 <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。アニメーション模範と時間をかけて代表的な女性被験者の水平位置。 <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。インタラクティブおよび非インタラクティブ同種および異種の雄の刺激で女性の協会の時間（秒）。各プロットは、プロトタイプでの位置の出力の5分間のレコードから作成されます。これらのプロットでは、時間は0〜5分の垂直Y方向に進行する。 <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。2つの対話の刺激によって代表アソシエーションの時間のデータと追跡。女性2人のための2つの5分間のセグメントが表示されます。

<ol>
	<li>Fisher, H. S., Mascuch, S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+male+traits+misalign+with+multivariate+female+preferences+in+the+swordtail+fish,+Xiphophorus+birchmanni.">Multivariate male traits misalign with multivariate female preferences in the swordtail fish, Xiphophorus birchmanni.</a> Anim. Behav. 78, 265-269 (2009).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hungry+females+show+stronger+mating+preferences.">Hungry females show stronger mating preferences.</a> Behavioral Ecology. 17, 979-981 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+swordtails+court+with+an+audience+in+mind.">Male swordtails court with an audience in mind.</a> Biology Letters. 3, 5-7 (2007).</li><li>Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+disdain+for+swords+in+a+swordtail+fish.">Female disdain for swords in a swordtail fish.</a> American Naturalist. 167, 136-140 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+chemical+environment+disrupts+communication+in+a+freshwater+fish.">Alteration of the chemical environment disrupts communication in a freshwater fish.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273, 1187-1193 (2006).</li><li>Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+considerations+and+techniques+for+constructing+video+stimuli.">Design considerations and techniques for constructing video stimuli.</a> Acta Ethol. 3, 49-54 (2000).</li><li>Turnell, E. R., Mann, K. D., Rosenthal, G. G., Gerlach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+zebrafish+(Danio+rerio)+analyzed+with+video-stimulus+techniques.">Mate choice in zebrafish (Danio rerio) analyzed with video-stimulus techniques.</a> Biol. Bull. 205, 225-226 (2003).</li><li>Rosenthal, G. G., Ryan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assortative+preferences+for+stripes+in+danios.">Assortative preferences for stripes in danios.</a> Animal Behaviour. 70, 1063-1066 (2005).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocks,+herds+and+schools:+A+distributed+behavioral+model.">Flocks, herds and schools: A distributed behavioral model.</a> , 256 (1985).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steering+Behaviors+For+Autonomous+Characters.">Steering Behaviors For Autonomous Characters.</a> , (1999).</li><li>Hoare, D. J., Couzin, I. D., Godin, J. -. G. J., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+group+size+choice+in+fish.">Context-dependent group size choice in fish.</a> Animal Behaviour. 65, 663-669 (2004).</li><li>Hoare, D. J. &. a. m. p. ;. a. m. p., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+organisation,+shoal+structure+and+information+transfer.">Social organisation, shoal structure and information transfer.</a> Fish and Fisheries. 4, 269-279 (2003).</li></ol>

このビデオ記事の生産はBiobserve研究が後援した。

動物行動におけるインタラクティブなビデオ再生のためのこれまでの方法は、被験者からの行動合図に応答を提供するために、人間のオペレータに依存している。 IVPで、我々は被験者の行動にリアルタイムの、自動化されたデータに応答して、ルールベースの​​インタラクティビティを適用したプログラムを作成しました。我々は、以下に簡単にプログラムを作成する手順を概説します。 最初のステップは、Xのデジタル男性の手本を作成することでしたbirchmanniとX. malinche。我々は以前の研究6と同様のアプローチを取りました。私たちは、本物のXの写真に基づいてテクスチャをモデルにしている3Dメッシュを作成birchmanniとX. malinche。本物の魚、魚の形状をモデル化するために使用したのと同じ写真のリアルなテクスチャをキャプチャするために魚のテクスチャとして使用された。彼らのUVに適用される平面地図は、写真のテクスチャのUVマップを整列座標。第二に、デジタル魚のメッシュは、本物の魚のように変形する必要があります。これを達成するために、仮想骨格は、人体とフィンのために作成され、メッシュに&quot;スキン&quot;。スキニング処理ではジョイントが回転しているときにメッシュが変形することが可能になります。 第二に、我々はデジタル魚にモーションを追加しました。男性ソードテールフィッシュが行う六キーの動きはアニメーションだった。運動の3つは魚が泳ぐというときの異なる速度を表すために使用されていました。他の3つの動きは、回転、または横方向の求愛ディスプレイを展示、依然として残っている魚だった。男性は男性または女性の受信機が3存在するかどうかにしたがって、その背びれを上下できるので、横方向求愛ディスプレイとは背びれの動きをデカップリングしてください。背びれは、それがサイクル中の任意の時点で上がったり下がったりすることができるように、キーが付いていた。二十から四アニメーションサイクルの合計が使用されました。各サイクルが開始され、アニメーションサイクルを簡単にブレンドできるように同じ姿勢で魚で終わった。二十から四アニメーションサイクルのすべては、男性のXを求愛、ロトスコーピング7,8ライブのオーバーヘッドビデオから目的のモーションによって作成されたbirchmanni。 第三に、我々は、双方向性を有効にする。我々はリアルタイムで鼻、ボディ、そして女性のソードテールのテールの位置を追跡し、IVPプログラムにリアルタイムでその情報を送信するBiobserveビューアのシステムを使用する。これは、各モニターにそれぞれの求愛男性のために別々に行われていた。男性のアニメーションは、対象魚の位置を追った。我々は、レイノルズはそれが女性に近づくにつれて、男性が女性をフォローし、減速するために許可されてステアリングの動作9,10、到着した使用して、以下のモデル化。 各時間ステップごとに男性ソードテールの魚の位置を計算するには、システムは男性の駆動力を計算するプログラムを許可された女性の現在位置、付属し​​ていた。最初に、ターゲットオフセットベクトルは、メスの魚の位置からオスの魚の位置を差し引くことにより算出した。メスの魚のオスの魚から2番目の距離は、ターゲットオフセットベクトルの大きさを考慮することによって決定した。第三に、オスの魚の希望する速度は、一定の減速度の値によって距離で割ることにより決定した。これは、メスの魚に近づくとオスの魚がスローダウンすることができました。最後に、所望の加速度が目標速度から男性の現在の速度を差し引くことにより算出した。 アニメーションを60 Hzでビデオの離散的なフレームとしてレンダリングされるため、計算は0.016秒の間隔で、各離散時間ステップのために作られました。最大速度は、これらの実験のための10センチメートル/ sの値に設定されていました。新しい速度の大きさは最大速度より大きい場合、速度は最大値に設定されていました。 この特定のシミュレーションでは、インタラクティブな男性の魚は、背びれの時間の50％を調達し、唯一の求愛の対話中に。男性の刺激は、Z次元の女性ソードテールの魚の0.25本体の長さの中でされるたびに横方向の求愛ディスプレイの動作がトリガされました。 我々は、双方向性は、非インタラクティブなアニメーションが強い選好を惹起し、女性がインタラクティブな刺激と会合時間の大半を費やしたことを考えるにもかかわらず、同種のための女性の好みを廃止することに驚いた。一つの可能​​性は密接に以下の女性がそのような剣や背びれのような男性を評価するために使用される視覚的な手がかりを、上書きする可能性があるということです。また、女性は、個人（図5）の両方をサンプリングする可能性が低くあまり求愛男性の興味を失ってしまう、そのためかもしれません。 それにもかかわらず、我々の結果はすなわち、ビデオゲームの技術の動作原理、ユーザー入力に応答するソフトウェア駆動型、ルールベースの​​エージェントが正常の研究でインタラクティブな再生に適用できることを示している動物の行動。ルールベースのインタラクティブな再生のこのタイプは、shoalingと集団運動11,12の研究に有用であることが分かるはず。特に、仮想手本がshoalingに使用するルールを操作する能力は、動物がshoaling意思決定を行うために使用するプロセスに私たちの洞察力を与える必要があります。

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Maya 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C# program using Microsoft&#x2019;s XNA Game Studio 2.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BIOBSERVE Viewer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell 15&#x201D; CRT monitor (2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 X 20 X 80 cm Plexiglas testing aquarium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell Latitude computer (animation server)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated interactive video playback for studies of animal communication

ビデオ再生には、動物のコミュニケーションにおける視覚信号の制御された操作とプレゼンテーションのための広く使用されているテクニックです。特に、パラメータベースのコンピュータアニメーションは、独立して画面上の動物の現実的な、動画像の文脈において、行動形態学的、またはスペクトル特性の任意の数を操作する機会を提供しています。従来の再生の主要な制限は、しかし、視覚刺激が生きている動物と対話する能力を欠いているということです。ビデオゲームの技術からの借入は、我々は、ビデオトラッキングシステムからのリアルタイム信号に応じてアニメーションを制御するビデオの再生のための自動化、インタラクティブなシステムを作成しました。私たちは、女性のソードテールの魚、Xiphophorus birchmanniでMATE -選択肢の試験を行うことにより、この方法を示しました。女性は水族館の反対側に同種の求愛男性と異種求愛男性（X. malinche）間の同時選択を与えられた。求愛男性が野生でするように仮想男性刺激は、女性の水平方向の位置を追跡するためにプログラムされました。野生で捕獲されたX上MATE -選択試験birchmanniの女性が効果的に現実的な視覚刺激を生成するプロトタイプの能力を検証するために使用されていました。

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Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

ビデオ再生には、動物の行動に広く使用されている技術です。我々は、被験者の行動にリアルタイムの、自動化されたデータに応じて3次元のコンピュータアニメーションのルールに基づく、インタラクティブな再生を適用するプログラムを作成し、評価した。

アニマルコミュニケーションの研究のための自動化されたインタラクティブなビデオ再生

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

automated-interactive-video-playback-for-studies-animal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K ビュー.  Texas A&M University (TAMU). ビデオ再生には、動物の行動に広く使用されている技術です。我々は、被験者の行動にリアルタイムの、自動化されたデータに応じて3次元のコンピュータアニメーションのルールに基づく、インタラクティブな再生を適用するプログラムを作成し、評価した。

ビデオ: Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

神経科学

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

行動神経科学のための齧歯類定位手術と動物福祉のアウトカムの改善

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

齧歯類のために全体の動物灌流固定

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment and Communication for People with Disorders of Consciousness

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the level of consciousness of people unable to provide motor response and, in a second stage, establishing a communication channel for these people that enables them to answer questions with either &#39;yes&#39; or &#39;no&#39;. The suite of paradigms is designed to test basic responses in the first step and to continue to more comprehensive tasks if the first tests are successful. The latter tasks require more cognitive functions, but they could provide communication, which is not possible with the basic tests. All assessment tests produce accuracy plots that show whether the algorithms were able to detect the patient&#39;s brain&#39;s response to the given tasks. If the accuracy level is beyond the significance level, we assume that the subject understood the task and was able to follow the sequence of commands presented via earphones to the subject. The tasks require users to concentrate on certain stimuli or to imagine moving either the left or right hand. All tasks are designed around the assumption that the user is unable to use the visual modality, and thus, all stimuli presented to the user (including instructions, cues, and feedback) are auditory or tactile.

With this experiment, one might be able to detect consciousness in people with disorders of consciousness. Furthermore, the approach can create a simple communication channel that enables people to give simple YES/NO answers to questions.

意識障害患者の評価とコミュニケーション

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...