この作業は神経通信技術センター（CNCT）、生物医学イメージングとバイオの国立研究所（NIBIB、P41 EB002030）によって資金を供給され、国立衛生研究所（NIH）でサポートされているP41リソースセンターによって資金を供給された。

1。固定液を準備する （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 2。灌流バッファを準備します。 （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 3。装置および麻酔を準備します。 <ol><li> 37水浴、暖かい血バッファを使用し℃、バッファーを満たしたビーカー中で出口弁を配置します。バッファー50 mlシリンジを記入し、固定チューブに接続します。バッファを追放し、撤退によって繰り返しチューブをフラッシュします。 </li><li>チューブ内のすべての気泡が除去されるまで、バッファの行をクリアします。それは、行のいずれかに気泡を持っていないように血流の成功のために重要である。 </li><li>シリンジを取り外し、4％パラホルムアルデヒド固定（室温）容器を接続します。容器にチューブを配置しながら、チューブ端で空気の泡を避けるために、チューブを絞るように、エンドトンからバッファ突出のドロップ容器内の液体表面に接触O。 </li><li>出口ポート（ニードルの端）を閉じます。固定バルブ（白）と同じ位置にバッファーバルブ（青）を回します。これは、バッファラインからの流れをできるようになります。 </li><li>出口ポートを開くとバッファラインを充填するためのA3 A1からステップを繰り返します。すべての気泡がチューブに気泡を導入しないように注意しながら、注射器を削除し、バッファー容器を接続し、出口ポートを閉じて排除された後。 </li><li>ゴム製の圧力計のブラブをポンプで圧力を保持する能力のためのシステムをテストします。システム内の空気の圧縮性に起因するいくつかの抵抗が通常あります。 </li><li>アクセスの容易なために、手術ツールをセットアップします。気泡の可能性を排除するために緩衝液を灌流針を記入してください。 </li><li>手術前に、キシラジン/ケタミン混合物（最大80 mg / kg体重のケタミンおよび10 mg / kg体重のキシラジン）腹腔内注射（27ゲージ針と1ccの注射器）を介して投与され。麻酔薬の追加投与は、麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて実行されます。 </li></ol> 4。血流外科<ol><li>動物が麻酔の外科的平面に達すると、砕いた氷で満たされた浅いトレイの上に置きます。 （麻酔の深さを決定するためにつま先ピンチ応答メソッドを使用します。続行する前に動物が応答しなければなりません）。 </li><li>ちょうど肋骨の下の外皮と腹壁を介して5〜6センチメートル横切開を行います。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。 </li><li>湾曲した、鈍いはさみを使って横隔膜に小切開を行います。指の位置と圧力がダイアフラムを削減するための能力を支援することができます。 </li><li>胸膜腔を公開するために肋骨の全長に沿って横隔膜切開を続行します。 </li><li>注意深く肺を変位、肋骨の片側に沿って湾曲した、鈍いはさみを配置し、cuを作るアップ鎖骨に肋骨を介してT。反対側も同様のカットを行います。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げ、慎重に心臓に接続する任意の組織をトリミングします。止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。正常に完了したら、胸腺は、主要な血管の明確なビューを提供し、胸骨と一緒に中心から離れて持ち上げる。 </li><li>アイリスのはさみを使用して左心室の後端に小さな切開を行います。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <ol start="8"><li>上行大動脈にカット心室を通して15ゲージ平滑末端またはオリーブ先端灌流針を渡します。先端が大動脈の壁を通して見えるようにする必要があり、上腕動脈と頸動脈動脈が分岐する大動脈弓に到達してはいけません。 </li><li>心をクランプするために止血剤を使用して、これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。必要に応じて、変更された止血剤（これらのhemostatsは解剖が始まるまでの場所に残りますが、明確にするために、将来のイラストから省略されています）針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。 </li><li>最後に、下行大動脈を損傷することなくできるだけ大きな口を作成するにはアイリスのはさみを使って動物の右心房に切開を行います。この時点で、動物は灌流する準備ができました。 </li></ol> 5。かん流<ol><li>気泡を導入しないように注意しながら針をベースに、出口ポートを開いて、添付してください。 </li><li>迅速＆均等に80ミリメートルHgの圧力に圧力計の電球を上げる。バッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。タイマーを開始します。 </li><li>針の角度を調整します。針の角度は最大流量（角度調整付流量の変化に注意してください）​​の達成に重要である。 </li><li>バフを切り替えるERバルブ（青色）バッファがほぼ完成された後（200ミリリットル）。流体は、明確な実行する必要があります。肝臓のクリアは良い灌流の指標である。肝臓はこの時点で明確にする必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>固定の震えは、数秒以内に観察する必要があり、これは固定の真の時間を考慮する必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>圧力は徐々に安定した流量を維持するために130ミリメートルHgの2の最大値まで増加することができます。 </li><li>固定がほぼ終了した後、出口バルブを閉じます。あなたの記録の終了時間を示します。 </li><li>ラットは、この段階では硬い必要があります。 </li><li>使用されるホルムアルデヒドは、あなたの機関の規制に従って廃棄を収集し、保管する必要があります。 </li></ol> 6。解剖4,11 <ol><li>はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 </li><li>首から鼻まで外皮に沿って正中切開を行い、公開頭蓋骨。 </li><li>頭蓋底が露出されるように残っている首の筋肉を切り落とす、はさみまたはrongeursを使用して、任意の残留筋肉を削除します。 </li><li>慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせ、一方の側に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い端に配置します。 </li><li>次に、後頭蓋表面の遠位端まで延びる切断してください。反対側で同じカットを行います。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 </li><li>先端は、脳への損傷を防ぐために切断されるブレードを持ち上げ、背側遠位後方隅から頭蓋骨の先端の正面の端に移動するよう慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。反対側に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>脳から離れて、頭蓋骨の背面皮rongeursを使用します。同様rongeursを使用して、頭蓋骨の両側を切り落とす。 </li><li>スパチュラを用いて、嗅球と神経接続を切断脳の腹側表面に沿ってtions。 </li><li>優しく、まだアイリスはさみを使って頭蓋骨に脳を接続し、任意の硬膜をトリミング、離れて頭から脳をいじめる。 </li><li>脳を除去し、固定液を含有する流体脳自体の体積の少なくとも10倍のバイアルに入れてください。バイアル時折渦。 </li></ol> 7。ポスト固定＆ストレージ<ol><li>時折渦巻く、4°Cで24時間固定の脳を保つ。 </li><li> 24時間後、培地を3回交換し、それぞれの時間を渦巻くことによりリン酸緩衝化生理食塩と脳を洗ってください。 </li><li>脳は、その後リン酸塩に格納することができますアジ化ナトリウムを含む生理食塩水またはHBHSバッファと4℃に保った</li></ol> 8。代表的な結果灌流の成功の最初の指標は、鼻など四肢、耳、足など胸腺および肝臓（IHCワールド）などの内部器官のクリアです。脳の肉眼検査は、血液（淡黄色の外観に白）の血管voidを明らかにする。これは、染色と免疫組織化学のために運命づける組織切片内でもtrueになります。灌流の結果の最終的な指標は、組織内の微細構造の状態である。1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> 固定液の準備： </td></tr><tr><td> 8％のパラホルムアルデヒドの在庫を準備します。 </td></tr><tr><td><ol><li> 500ミリリットルのdH 2 Oに40グラムのパラホルムアルデヒドを追加します。 60〜ソリューションを加熱 - 65°C（65を超えないようにしてください°C、そう悪影響を免疫組織化学的手順の成功に影響を与える可能性）を攪拌しながら。 </li><li>ソリューションをクリアするには、熱を削減し、スポイトで1.0 M NaOHを2〜3 mlを加える。 </li><li>フィルタと最大1ヶ月から4℃で保存。 </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li>リン酸ナトリウム一塩基の在庫については、1 LのdH 2 Oに27.8グラムのNaH 2 PO 4 * H 2 Oを追加する</li><li>リン酸ナトリウム二塩基株式については、1 LのdH 2 Oに28.4グラムのNa 2 HPO 4を追加</li><li>塩基株式の190ミリリットルに一塩基株式の810ミリリットルを追加します。 </li></ol></td></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド固定液を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> 0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液に等量の8％パラホルムアルデヒドの在庫を追加します。 </li><li>注：この修正は最高のは、事前に72時間以上のものを新たに調製されていません。 </li></ol></td></tr><tr><td> 灌流およびストレージバッファを準備します。 </td></tr><tr><td> リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファの準備 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 LのdH 2 O </li><li> 9グラムのNaCl </li><li> 144 mgのKH 2 PO &lt;サブ&gt; 4 </li><li> 795ミリグラムのNa 2 HPO 4 </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr><tr><td> HEPESは、アジ化ナトリウムpH7.4でハンクス液（HBHS）をバッファ </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990ミリリットルのdH 2 O </li><li> 7.5グラムのNaCl、 </li><li> 0.3グラムのKCl </li><li> 0.06グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 0.13グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 2グラムのブドウ糖/グルコース</li><li> 2.4グラム10ミリメートルのHepes </li><li> 0.1グラムのMgCl 2 6部のdH 2 O </li><li> 0.05グラムのMgSO 4 7部のdH 2 O </li><li> 0.165グラムのCaCl 2 2部のdH 2 O </li><li> 90mgのNaN 3を </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr></tbody></table> 表1固定液とバッファーの調製。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> 図1。 </stronG&gt;ラベルコンポーネントと灌流装置。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> 図2：灌流装置I.の準備は固定行で開始します。気泡のチューブをフラッシュし、急速に注射器にし、ラインを介してバッファを追放し、撤退することで、バッファに記入してください。針側のバルブを遮断してください。気泡を導入することなく、固定瓶に固定行を置きます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 図3：灌流装置IIの調製。 1。針の端にバルブを開きます。 2。フローに配置するバッファバルブ（青）を回します。 3。気泡のチューブをフラッシュし、急速に追放し、シリンジでバッファを引き出すことによってバッファを使用して記入してください。 4。針の端にあるバルブを閉じます。バッファのボトルにチューブを置きます。システムが正しい密封されていることを確認する試験圧力圧力計の電球を汲み上げ、ゲージを見ながらLY。装置は、現在灌流手続きの準備ができています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 図4バッファの配信のための位置に灌流装置。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> 図5潅流手術I.）は、外皮と腹壁を介して横方向の切開を行います。 b）の横隔膜の切開を行い、心臓を露出させる横隔膜を横切る。アップ鎖骨にリブの両側に平行にカットします。 c）の止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> 図6。灌流手術II。 1）上行大動脈にカット心室を通して灌流針を渡します。 b）に固定灌流針が心臓をクランプするhemostatsのいずれかのセットを使用します。変更された止血剤の2番目のセットはまた、漏れを防止するために針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。アイリスのはさみを使用すると、左心室の後端に小さな切開を行います。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> 図7。ライン内の圧力を作成するためのバッファポンプ圧力計の電球と灌流。バルブ（1）を開くと、針ハブに接続します。それは空気の泡が導入されていないことを確認することが重要です。 80ミリメートルHgの圧力に圧力計バルブをポンプおよびバッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> 図8。固定液で灌流バッファがほぼ完成されるとは（200ミリリットル）が流れるように固定を可能にするためにバッファバルブ（1）を切り替えます。圧力は徐々にまで増加することができます130ミリメートルHgの最大値。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> 図9。解剖I.）は、はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 b）の首から鼻まで正中線に沿って皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開します。頭蓋底が露出されるように、c）の残りの首の筋肉を切り落とす。頭蓋表面の大開口部（大後頭孔）がアクセスできるように頭部を保持します。慎重に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い先端を挿入し、切断してください。反対側に同じ操作を繰り返します。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> 図10。解剖II。 1）慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。あなたは脳への損傷を防ぐために切断される先端を持ち上げます。のために同じことを繰り返す反対側。脳から離れ頭蓋骨皮rongeursを使用しています。 b）の頭蓋骨のイラストは削除され、脳が露出した。 c）の脳の最も前方の位置に嗅球神経接続を切断するヘラを使用しています。慎重に削除を容易にするために接続を切断するための脳の下面に沿ってヘラの先端をガイドします。脳を除去し、固定液のバイアルに入れてください。

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

手術の成功のために追加のメモ： <ol><li>ダイアフラムが破られると、低酸素症および高炭酸ガス血症は、その後の分析を混乱させることが不可逆的生理的変化を開始するとして急速に先行する。 </li><li>針を挿入し、所定の位置に固定されている場合、残圧は、ニードル（フラッシュバック）のベースに血液をプッシュします。実際には、大きな動物が精力的に血液を除名することができます。それは、血液が少なくとも灌流を完了するには、障害物を提示する気泡を導入することを避けるために針の根元に到達することが重要です。ない血液が針の基地で観測されていない場合は、灌流リグの出口ポートに接続することによってバッファを使用して針と詰め替えを削除します。バッファがチップを介して実行されると、針が心臓に再挿入することができます。 </li><li>大動脈内針の適切な配置が重要である、それは限り大動脈弓として到達してはいけません。 </li><li>複数perfusionsが行われている場合、それはトン必要はありません。毎回最初からoがセットアップ。ユーザは、各ボトル（200mls動物/溶液）内のバッファと固定の両方に適切なボリュームを持っている必要があります。必要に応じてボトルも補充することができます。考慮すべき最も重要な側面は、動物へのセットアップ（出力バルブ）から実行される灌流ラインをフラッシュしています。灌流終了後、この行は、その中に4％パラホルムアルデヒドを持っています。バッファボトルからチューブを外し、固定を洗い流すために水を満たした50 mlの注射器を使用しています。出口弁はホルムアルデヒドの適切な処分のための廃棄物収集ビーカーに入れていることを確認します。この3回繰り返します。 2.3に示すように、同じメソッドを使用してバッファを補給。 </li><li>固定のためにこの方法では、実験の要件に応じてバッファと固定その他の固定剤（例えば、EMに使用されるものなど）の両方を変更する能力を持つ高度に適応可能である。 </li><li>このシステムは、頻繁に生きている組織の抽出に使用されています。このためにプロセス1は、単にバッファの配信を使用するだけ（まだ全体のシステムに接続されている間にバッファーボトルをアイスバケットに配置され、固定ボトルが空ではなく密閉型として設定されています）。これは、最適な圧力で冷緩衝液灌流を保証します。ここからシステムがいずれか（量が問題にならない場合は）バッファに直接染料を追加したり、バッファ/バッファの間に染料溶液の最小限の量で注射器を使用することにより修正可能な染料の注入に適合させることができます - 固定ステップ。 </li><li>血管の鋳造の場合には、圧力監視バッファのステップは、50ミリリットル注射器のいずれかが（チューブ、バルブ、保持装置への直接配信や使い捨て二アタッチメントを使用する必要がありますしかし、粘度、鋳造ソリューションの本質を固めるために不可欠である現在のシステムとのインタフェースに加えられたコンテナ）を使用することができます。我々の研究室 &quot;血管のキャストは灌流装置の設計と製造を先行していた。したがって、我々は、stできません。圧力測定は、配信サイトで正確な測定であることを食べました。数字は、粘性流体の配信が成功を達成するために調整する必要があります。 </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 麻酔： </td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン混合物（麻酔が研究室/機関ごとに異なる​​場合があります） </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 mLのバイアル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 手術： </td></tr><tr><td>針の先端、27 GA×1.25 &quot; </td><td>資材·サービス</td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td>大鈍/鈍湾曲したハサミ（〜14.5センチメートル） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14519から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td&gt;標準ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11027から12 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン（グレーフェ）ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11050から10 </td><td></td></tr><tr><td> 1つの大きな止血鉗子 - 曲線または直線（〜19センチ） </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2標準止血鉗子 - ストレートセレーション（14センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 1変更された止血剤（チップを介して提出し、15ゲージ穴付） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 15ゲージの鈍またはオリーブ先端が針（灌流針） </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 灌流 ： </td></tr><tr><td> HyPerfusionシステムまたは同等の&lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4の緩衝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中4％パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浅いガラスまたはプラスチックトレイ、約10 &quot;×10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クラッシュアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴（37℃） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50mlの注射器</td><td> MEDLINE産業</td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖 ： </td></tr><tr><td>パ標準的な鋭い/鈍いストレートはさみのIR（〜12センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14054から13 </td><td></td></tr><tr><td>培地曲線または直線rongeurs（14-16 cm）または頭蓋骨除去ペンチ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 16020から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ（〜9センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ（ダブル2 &quot;フラット終了すると、1を丸め、円すい1〜1/8&quot;） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10091から12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ポスト·ボール＆ストレージ： </td></tr><tr><td> 50 mlのガラスバイアル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム（90mg / l）を40ミリリットルHEPES緩衝ハンクス溶液（HBHS） </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbodY&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

固定の目的は、急速にかつ均一に生きているような状態で組織を維持することです。固定は、同じレート5,7で組織のすべての領域に到達しないため組織の小さな断片は、無傷の脳の浸漬固定のために問題を引き起こすような大きな試料でも固定の作品に直接組織を配置しながら。組織が ​​保存される前に、多くの場合、低酸素への応答の変化は、12を開始します 。直接循環系を介して固定液を灌流することの利点は、化学物質がすぐに自然な血管網を用いた生物の隅々に到達することができるということです。最も効果的に循環系を利用するためには、注意が生理的な圧力を3と一致するように注意する必要があります。生理的な圧力が使用される種に依存していることに注意することが重要です。灌流固定するためのテクニックは、固定される組織によって異なり、どのように組織は、次の固定を処理されます。このビデオでラットの心臓を免疫組織化学のための脳の最良の保全を得るために：我々は、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。この技術の主な利点（対重力給電システム）は、循環器系が最も有効に活用されていることです。

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

齧歯類のために全体の動物灌流固定

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.3K ビュー.  University of Michigan. ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

ビデオ: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

アニマルコミュニケーションの研究のための自動化されたインタラクティブなビデオ再生

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

神経科学

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

げっ歯類における行動聴力検査のための低コストのセットアップ

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

げっ歯類での同時のfMRIと脳深部刺激

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

げっ歯類でのアクリル樹脂成形ベースヘッド固定法

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

齧歯動物の槽注入カニューレ

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

血管灌流固定を用いたマウス肺の空気膨張

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...