Name: whole animal perfusion fixation for rodents
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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この作業は神経通信技術センター（CNCT）、生物医学イメージングとバイオの国立研究所（NIBIB、P41 EB002030）によって資金を供給され、国立衛生研究所（NIH）でサポートされているP41リソースセンターによって資金を供給された。

1。固定液を準備する （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 2。灌流バッファを準備します。 （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 3。装置および麻酔を準備します。 <ol><li> 37水浴、暖かい血バッファを使用し℃、バッファーを満たしたビーカー中で出口弁を配置します。バッファー50 mlシリンジを記入し、固定チューブに接続します。バッファを追放し、撤退によって繰り返しチューブをフラッシュします。 </li><li>チューブ内のすべての気泡が除去されるまで、バッファの行をクリアします。それは、行のいずれかに気泡を持っていないように血流の成功のために重要である。 </li><li>シリンジを取り外し、4％パラホルムアルデヒド固定（室温）容器を接続します。容器にチューブを配置しながら、チューブ端で空気の泡を避けるために、チューブを絞るように、エンドトンからバッファ突出のドロップ容器内の液体表面に接触O。 </li><li>出口ポート（ニードルの端）を閉じます。固定バルブ（白）と同じ位置にバッファーバルブ（青）を回します。これは、バッファラインからの流れをできるようになります。 </li><li>出口ポートを開くとバッファラインを充填するためのA3 A1からステップを繰り返します。すべての気泡がチューブに気泡を導入しないように注意しながら、注射器を削除し、バッファー容器を接続し、出口ポートを閉じて排除された後。 </li><li>ゴム製の圧力計のブラブをポンプで圧力を保持する能力のためのシステムをテストします。システム内の空気の圧縮性に起因するいくつかの抵抗が通常あります。 </li><li>アクセスの容易なために、手術ツールをセットアップします。気泡の可能性を排除するために緩衝液を灌流針を記入してください。 </li><li>手術前に、キシラジン/ケタミン混合物（最大80 mg / kg体重のケタミンおよび10 mg / kg体重のキシラジン）腹腔内注射（27ゲージ針と1ccの注射器）を介して投与され。麻酔薬の追加投与は、麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて実行されます。 </li></ol> 4。血流外科<ol><li>動物が麻酔の外科的平面に達すると、砕いた氷で満たされた浅いトレイの上に置きます。 （麻酔の深さを決定するためにつま先ピンチ応答メソッドを使用します。続行する前に動物が応答しなければなりません）。 </li><li>ちょうど肋骨の下の外皮と腹壁を介して5〜6センチメートル横切開を行います。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。 </li><li>湾曲した、鈍いはさみを使って横隔膜に小切開を行います。指の位置と圧力がダイアフラムを削減するための能力を支援することができます。 </li><li>胸膜腔を公開するために肋骨の全長に沿って横隔膜切開を続行します。 </li><li>注意深く肺を変位、肋骨の片側に沿って湾曲した、鈍いはさみを配置し、cuを作るアップ鎖骨に肋骨を介してT。反対側も同様のカットを行います。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げ、慎重に心臓に接続する任意の組織をトリミングします。止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。正常に完了したら、胸腺は、主要な血管の明確なビューを提供し、胸骨と一緒に中心から離れて持ち上げる。 </li><li>アイリスのはさみを使用して左心室の後端に小さな切開を行います。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <ol start="8"><li>上行大動脈にカット心室を通して15ゲージ平滑末端またはオリーブ先端灌流針を渡します。先端が大動脈の壁を通して見えるようにする必要があり、上腕動脈と頸動脈動脈が分岐する大動脈弓に到達してはいけません。 </li><li>心をクランプするために止血剤を使用して、これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。必要に応じて、変更された止血剤（これらのhemostatsは解剖が始まるまでの場所に残りますが、明確にするために、将来のイラストから省略されています）針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。 </li><li>最後に、下行大動脈を損傷することなくできるだけ大きな口を作成するにはアイリスのはさみを使って動物の右心房に切開を行います。この時点で、動物は灌流する準備ができました。 </li></ol> 5。かん流<ol><li>気泡を導入しないように注意しながら針をベースに、出口ポートを開いて、添付してください。 </li><li>迅速＆均等に80ミリメートルHgの圧力に圧力計の電球を上げる。バッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。タイマーを開始します。 </li><li>針の角度を調整します。針の角度は最大流量（角度調整付流量の変化に注意してください）​​の達成に重要である。 </li><li>バフを切り替えるERバルブ（青色）バッファがほぼ完成された後（200ミリリットル）。流体は、明確な実行する必要があります。肝臓のクリアは良い灌流の指標である。肝臓はこの時点で明確にする必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>固定の震えは、数秒以内に観察する必要があり、これは固定の真の時間を考慮する必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>圧力は徐々に安定した流量を維持するために130ミリメートルHgの2の最大値まで増加することができます。 </li><li>固定がほぼ終了した後、出口バルブを閉じます。あなたの記録の終了時間を示します。 </li><li>ラットは、この段階では硬い必要があります。 </li><li>使用されるホルムアルデヒドは、あなたの機関の規制に従って廃棄を収集し、保管する必要があります。 </li></ol> 6。解剖4,11 <ol><li>はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 </li><li>首から鼻まで外皮に沿って正中切開を行い、公開頭蓋骨。 </li><li>頭蓋底が露出されるように残っている首の筋肉を切り落とす、はさみまたはrongeursを使用して、任意の残留筋肉を削除します。 </li><li>慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせ、一方の側に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い端に配置します。 </li><li>次に、後頭蓋表面の遠位端まで延びる切断してください。反対側で同じカットを行います。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 </li><li>先端は、脳への損傷を防ぐために切断されるブレードを持ち上げ、背側遠位後方隅から頭蓋骨の先端の正面の端に移動するよう慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。反対側に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>脳から離れて、頭蓋骨の背面皮rongeursを使用します。同様rongeursを使用して、頭蓋骨の両側を切り落とす。 </li><li>スパチュラを用いて、嗅球と神経接続を切断脳の腹側表面に沿ってtions。 </li><li>優しく、まだアイリスはさみを使って頭蓋骨に脳を接続し、任意の硬膜をトリミング、離れて頭から脳をいじめる。 </li><li>脳を除去し、固定液を含有する流体脳自体の体積の少なくとも10倍のバイアルに入れてください。バイアル時折渦。 </li></ol> 7。ポスト固定＆ストレージ<ol><li>時折渦巻く、4°Cで24時間固定の脳を保つ。 </li><li> 24時間後、培地を3回交換し、それぞれの時間を渦巻くことによりリン酸緩衝化生理食塩と脳を洗ってください。 </li><li>脳は、その後リン酸塩に格納することができますアジ化ナトリウムを含む生理食塩水またはHBHSバッファと4℃に保った</li></ol> 8。代表的な結果灌流の成功の最初の指標は、鼻など四肢、耳、足など胸腺および肝臓（IHCワールド）などの内部器官のクリアです。脳の肉眼検査は、血液（淡黄色の外観に白）の血管voidを明らかにする。これは、染色と免疫組織化学のために運命づける組織切片内でもtrueになります。灌流の結果の最終的な指標は、組織内の微細構造の状態である。1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> 固定液の準備： </td></tr><tr><td> 8％のパラホルムアルデヒドの在庫を準備します。 </td></tr><tr><td><ol><li> 500ミリリットルのdH 2 Oに40グラムのパラホルムアルデヒドを追加します。 60〜ソリューションを加熱 - 65°C（65を超えないようにしてください°C、そう悪影響を免疫組織化学的手順の成功に影響を与える可能性）を攪拌しながら。 </li><li>ソリューションをクリアするには、熱を削減し、スポイトで1.0 M NaOHを2〜3 mlを加える。 </li><li>フィルタと最大1ヶ月から4℃で保存。 </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li>リン酸ナトリウム一塩基の在庫については、1 LのdH 2 Oに27.8グラムのNaH 2 PO 4 * H 2 Oを追加する</li><li>リン酸ナトリウム二塩基株式については、1 LのdH 2 Oに28.4グラムのNa 2 HPO 4を追加</li><li>塩基株式の190ミリリットルに一塩基株式の810ミリリットルを追加します。 </li></ol></td></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド固定液を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> 0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液に等量の8％パラホルムアルデヒドの在庫を追加します。 </li><li>注：この修正は最高のは、事前に72時間以上のものを新たに調製されていません。 </li></ol></td></tr><tr><td> 灌流およびストレージバッファを準備します。 </td></tr><tr><td> リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファの準備 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 LのdH 2 O </li><li> 9グラムのNaCl </li><li> 144 mgのKH 2 PO &lt;サブ&gt; 4 </li><li> 795ミリグラムのNa 2 HPO 4 </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr><tr><td> HEPESは、アジ化ナトリウムpH7.4でハンクス液（HBHS）をバッファ </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990ミリリットルのdH 2 O </li><li> 7.5グラムのNaCl、 </li><li> 0.3グラムのKCl </li><li> 0.06グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 0.13グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 2グラムのブドウ糖/グルコース</li><li> 2.4グラム10ミリメートルのHepes </li><li> 0.1グラムのMgCl 2 6部のdH 2 O </li><li> 0.05グラムのMgSO 4 7部のdH 2 O </li><li> 0.165グラムのCaCl 2 2部のdH 2 O </li><li> 90mgのNaN 3を </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr></tbody></table> 表1固定液とバッファーの調製。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> 図1。 </stronG&gt;ラベルコンポーネントと灌流装置。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> 図2：灌流装置I.の準備は固定行で開始します。気泡のチューブをフラッシュし、急速に注射器にし、ラインを介してバッファを追放し、撤退することで、バッファに記入してください。針側のバルブを遮断してください。気泡を導入することなく、固定瓶に固定行を置きます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 図3：灌流装置IIの調製。 1。針の端にバルブを開きます。 2。フローに配置するバッファバルブ（青）を回します。 3。気泡のチューブをフラッシュし、急速に追放し、シリンジでバッファを引き出すことによってバッファを使用して記入してください。 4。針の端にあるバルブを閉じます。バッファのボトルにチューブを置きます。システムが正しい密封されていることを確認する試験圧力圧力計の電球を汲み上げ、ゲージを見ながらLY。装置は、現在灌流手続きの準備ができています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 図4バッファの配信のための位置に灌流装置。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> 図5潅流手術I.）は、外皮と腹壁を介して横方向の切開を行います。 b）の横隔膜の切開を行い、心臓を露出させる横隔膜を横切る。アップ鎖骨にリブの両側に平行にカットします。 c）の止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> 図6。灌流手術II。 1）上行大動脈にカット心室を通して灌流針を渡します。 b）に固定灌流針が心臓をクランプするhemostatsのいずれかのセットを使用します。変更された止血剤の2番目のセットはまた、漏れを防止するために針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。アイリスのはさみを使用すると、左心室の後端に小さな切開を行います。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> 図7。ライン内の圧力を作成するためのバッファポンプ圧力計の電球と灌流。バルブ（1）を開くと、針ハブに接続します。それは空気の泡が導入されていないことを確認することが重要です。 80ミリメートルHgの圧力に圧力計バルブをポンプおよびバッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> 図8。固定液で灌流バッファがほぼ完成されるとは（200ミリリットル）が流れるように固定を可能にするためにバッファバルブ（1）を切り替えます。圧力は徐々にまで増加することができます130ミリメートルHgの最大値。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> 図9。解剖I.）は、はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 b）の首から鼻まで正中線に沿って皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開します。頭蓋底が露出されるように、c）の残りの首の筋肉を切り落とす。頭蓋表面の大開口部（大後頭孔）がアクセスできるように頭部を保持します。慎重に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い先端を挿入し、切断してください。反対側に同じ操作を繰り返します。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> 図10。解剖II。 1）慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。あなたは脳への損傷を防ぐために切断される先端を持ち上げます。のために同じことを繰り返す反対側。脳から離れ頭蓋骨皮rongeursを使用しています。 b）の頭蓋骨のイラストは削除され、脳が露出した。 c）の脳の最も前方の位置に嗅球神経接続を切断するヘラを使用しています。慎重に削除を容易にするために接続を切断するための脳の下面に沿ってヘラの先端をガイドします。脳を除去し、固定液のバイアルに入れてください。

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

手術の成功のために追加のメモ： <ol><li>ダイアフラムが破られると、低酸素症および高炭酸ガス血症は、その後の分析を混乱させることが不可逆的生理的変化を開始するとして急速に先行する。 </li><li>針を挿入し、所定の位置に固定されている場合、残圧は、ニードル（フラッシュバック）のベースに血液をプッシュします。実際には、大きな動物が精力的に血液を除名することができます。それは、血液が少なくとも灌流を完了するには、障害物を提示する気泡を導入することを避けるために針の根元に到達することが重要です。ない血液が針の基地で観測されていない場合は、灌流リグの出口ポートに接続することによってバッファを使用して針と詰め替えを削除します。バッファがチップを介して実行されると、針が心臓に再挿入することができます。 </li><li>大動脈内針の適切な配置が重要である、それは限り大動脈弓として到達してはいけません。 </li><li>複数perfusionsが行われている場合、それはトン必要はありません。毎回最初からoがセットアップ。ユーザは、各ボトル（200mls動物/溶液）内のバッファと固定の両方に適切なボリュームを持っている必要があります。必要に応じてボトルも補充することができます。考慮すべき最も重要な側面は、動物へのセットアップ（出力バルブ）から実行される灌流ラインをフラッシュしています。灌流終了後、この行は、その中に4％パラホルムアルデヒドを持っています。バッファボトルからチューブを外し、固定を洗い流すために水を満たした50 mlの注射器を使用しています。出口弁はホルムアルデヒドの適切な処分のための廃棄物収集ビーカーに入れていることを確認します。この3回繰り返します。 2.3に示すように、同じメソッドを使用してバッファを補給。 </li><li>固定のためにこの方法では、実験の要件に応じてバッファと固定その他の固定剤（例えば、EMに使用されるものなど）の両方を変更する能力を持つ高度に適応可能である。 </li><li>このシステムは、頻繁に生きている組織の抽出に使用されています。このためにプロセス1は、単にバッファの配信を使用するだけ（まだ全体のシステムに接続されている間にバッファーボトルをアイスバケットに配置され、固定ボトルが空ではなく密閉型として設定されています）。これは、最適な圧力で冷緩衝液灌流を保証します。ここからシステムがいずれか（量が問題にならない場合は）バッファに直接染料を追加したり、バッファ/バッファの間に染料溶液の最小限の量で注射器を使用することにより修正可能な染料の注入に適合させることができます - 固定ステップ。 </li><li>血管の鋳造の場合には、圧力監視バッファのステップは、50ミリリットル注射器のいずれかが（チューブ、バルブ、保持装置への直接配信や使い捨て二アタッチメントを使用する必要がありますしかし、粘度、鋳造ソリューションの本質を固めるために不可欠である現在のシステムとのインタフェースに加えられたコンテナ）を使用することができます。我々の研究室 &quot;血管のキャストは灌流装置の設計と製造を先行していた。したがって、我々は、stできません。圧力測定は、配信サイトで正確な測定であることを食べました。数字は、粘性流体の配信が成功を達成するために調整する必要があります。 </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 麻酔： </td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン混合物（麻酔が研究室/機関ごとに異なる​​場合があります） </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 mLのバイアル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 手術： </td></tr><tr><td>針の先端、27 GA×1.25 &quot; </td><td>資材·サービス</td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td>大鈍/鈍湾曲したハサミ（〜14.5センチメートル） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14519から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td&gt;標準ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11027から12 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン（グレーフェ）ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11050から10 </td><td></td></tr><tr><td> 1つの大きな止血鉗子 - 曲線または直線（〜19センチ） </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2標準止血鉗子 - ストレートセレーション（14センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 1変更された止血剤（チップを介して提出し、15ゲージ穴付） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 15ゲージの鈍またはオリーブ先端が針（灌流針） </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 灌流 ： </td></tr><tr><td> HyPerfusionシステムまたは同等の&lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4の緩衝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中4％パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浅いガラスまたはプラスチックトレイ、約10 &quot;×10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クラッシュアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴（37℃） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50mlの注射器</td><td> MEDLINE産業</td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖 ： </td></tr><tr><td>パ標準的な鋭い/鈍いストレートはさみのIR（〜12センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14054から13 </td><td></td></tr><tr><td>培地曲線または直線rongeurs（14-16 cm）または頭蓋骨除去ペンチ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 16020から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ（〜9センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ（ダブル2 &quot;フラット終了すると、1を丸め、円すい1〜1/8&quot;） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10091から12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ポスト·ボール＆ストレージ： </td></tr><tr><td> 50 mlのガラスバイアル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム（90mg / l）を40ミリリットルHEPES緩衝ハンクス溶液（HBHS） </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbodY&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

固定の目的は、急速にかつ均一に生きているような状態で組織を維持することです。固定は、同じレート5,7で組織のすべての領域に到達しないため組織の小さな断片は、無傷の脳の浸漬固定のために問題を引き起こすような大きな試料でも固定の作品に直接組織を配置しながら。組織が ​​保存される前に、多くの場合、低酸素への応答の変化は、12を開始します 。直接循環系を介して固定液を灌流することの利点は、化学物質がすぐに自然な血管網を用いた生物の隅々に到達することができるということです。最も効果的に循環系を利用するためには、注意が生理的な圧力を3と一致するように注意する必要があります。生理的な圧力が使用される種に依存していることに注意することが重要です。灌流固定するためのテクニックは、固定される組織によって異なり、どのように組織は、次の固定を処理されます。このビデオでラットの心臓を免疫組織化学のための脳の最良の保全を得るために：我々は、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。この技術の主な利点（対重力給電システム）は、循環器系が最も有効に活用されていることです。

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

齧歯類のために全体の動物灌流固定

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

381.2K ビュー.  University of Michigan. ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

ビデオ: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

医学

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

神経科学

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

マウスにおける下腹部および後肢の脳閉回路灌流における確立

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To maintain the morphology of these delicate tissues, it is routine to administer a chemical fixative such as paraformaldehyde via cannulation of the heart in anesthetized animals (transcardial perfusion). Transcardial perfusion of the mouse heart has traditionally relied on the use of peristaltic pumps or air pressure to deliver both the saline and fixative solutions necessary for this process. As an easily accessible alternative to these methods, this work demonstrates the use of a gravity-fed method of perfusate delivery that uses materials available in most hardware stores. 
To validate this new perfusion method, this work demonstrates all the subsequent steps necessary for the sensitive detection of phosphorylated &#945;-synuclein in both the brain and spinal cord. Included in these steps are the dissection of the fixed brain and spinal cord tissues, rapid freezing/embedding and cryosectioning of the tissues, and immunofluorescent staining. As this method results in whole-body delivery of the fixative, it may also be used to prepare other non-neuronal tissues for histologic analysis.

A convenient gravity-fed perfusion method for histological analysis of the mouse central nervous system is presented. Immunofluorescent detection of phosphorylated &#945;-synuclein is demonstrated in a mouse model of Parkinson's disease. This work also comprehensively describes the transcardial perfusion, dissection, tissue freezing/embedding, and frozen sectioning steps.

マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

<meta charset="utf8"></head><body>Neurolucida 360を使用した樹状突起脊椎解析のプロトコル

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed on dendritic spines. Dendritic spines are structures of great interest in research centered around synaptic plasticity, neurodevelopment, and neurological and psychiatric disorders. Dendritic spines undergo structural modifications during their lifespan, with properties such as total spine number, dendritic spine size, and morphologically defined subtype altering in response to different processes. Delineating the molecular mechanisms regulating these structural alterations of dendritic spines relies on morphological measurement. This mandates accurate and reproducible dendritic spine analysis to provide experimental evidence. The present study outlines a detailed protocol for dendritic spine quantification and classification using Neurolucida 360 (automatic three-dimensional neuron reconstruction software). This protocol allows for the determination of key dendritic spine properties such as total spine density, spine head volume, and classification into spine subtypes thus enabling effective analysis of dendritic spine structural phenotypes.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト: 海馬 CA1 頂端樹状突起におけるバランスの取れた手動および自動評価のための樹状突起スパイン解析の最適化

Dendritic spines are post-synaptic compartments of most excitatory synapses. Alterations to dendritic spine morphology occur during neurodevelopment, aging, learning, and many neurological and psychiatric disorders, underscoring the importance of reliable dendritic spine analysis. This protocol describes quantifying dendritic spine morphology accurately and reproducibly using automatic three-dimensional neuron reconstruction software.

自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...