この方法は、神経科学、特にニューロンソケット形成に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が生きている新生児マウスの個々のニューロンの形態学的変化を分析できることです。麻酔を受けた出生後5日目の子犬から始まり、尾のピンチテストに対する反応がない場合にのみ進みます。
まず、頭皮を70%エタノールで拭いて滅菌します。その後、70%エタノールで殺菌したハサミを使用して、頭蓋骨を覆う皮膚の約20平方ミリメートルを除去する。次に、皮質緩衝液に浸した無菌鉗子と清潔な綿棒を使用して、頭蓋骨の筋膜を取り除く。
画像化する領域を避けながら、切開された皮膚表面に組織接着剤を塗布し、出血を止めるために負荷チップを使用してください。別の加熱パッドに子犬を置き、摂氏37度に設定し、麻酔から回復させます。組織接着剤が乾燥し固まるまで約30分待ちます。
組織接着剤が乾燥したら、再麻酔マウス上で頭蓋窓の調製を開始します。頭蓋骨に皮質バッファーの1滴を適用し、その後、慎重に頭蓋骨の直径1ミリメートルの領域を開くために滅菌カミソリブレードを使用して、デュラをそのまま残します。脳表面を湿らせた保つために皮質バッファーを適用します。.
皮質バッファーに浸したゼラチンスポンジの小片を使用して、出血を止めます。新鮮な部分を使用して頭蓋骨切除術の片側を圧縮し、硬膜に触れることなく硬膜表面から任意のバッファーと血液を排出します。これは、ウィンドウをクリアする最も重要な手順です。
硬膜は損傷を受けていない必要があり、ブラシは露出した硬膜から取り除く必要があります。次に、ピペットチップを使用して、皮質緩衝液に溶解した1%低融解アガロースの薄層を適用する。円形の3ミリメートルのガラスカバースリップをアガロースゲル層に塗布します。
カバースリップとアガロースゲル層の間にアガロースゲルを過剰に注ぎ込んで、すべての気泡を取り除きます。ピンセットを使用して余分なゲルを取り除き、カバースリップの下から突き出します。セメントパウダーとセメント液を混ぜます。
ピペットチップを使用して、固まる前に頭蓋骨に混合物を適用します。次に、歯科用セメントを使用して頭蓋骨にカスタムメイドのチタンバーを取り付けます。チタンバーを合わせ、カバースリップを平行にして画像を簡単にキャプチャします。
露出した頭蓋骨を歯科用セメントで覆います。次いで、皮下鎮痛を注射する。歯セメントが固まるまで1時間、摂氏37度のヒートパッドの回復ケージに子犬を置きます。
イメージングを開始するには、まず2光子レーザー波長を設定します。RFP励起には、1000ナノメートルの波長を使用してください。カバースリップの表面を70%エタノールで拭きます。
麻酔付きの子犬を、チタンバーを使用して、イメージングステージのチタンプレートに取り付けます。ゴニオメータステージを使用して、カバースリップが対物レンズに平行になるようにヘッドを調整します。37°Cに設定した加熱パッドを使用してイメージング中に子犬の体温を維持し、イソフルラン濃度を0.7%から1%に下げ、2つの光子顕微鏡の20倍の対物レンズの下にイメージング段階を置きます。
カバースリップに1滴の水を塗ります。Zスタックイメージを1.4ミクロン間隔で取得するようにソフトウェアを設定します。レイヤ 4 ニューロン イメージングの場合、Z 幅を 150 ~ 300 ミクロンに設定して樹状モルフォロジー全体をイメージします。
低速スキャンと平均を使用して、神経形態を示す鮮明な画像を取得します。樹状形態全体を取得するのに通常20分以上かかります。この画像は、P5 pupの層4皮質ニューロンの代表的なZスタック画像を示しています。
矢印は、分析するニューロンを示します。デデンドライトがぼやけたニューロンは、分析から削除する必要があります。この画像は、前の画像で示されたニューロンのより高い拡大画像を示しています。
青い矢印は、次の時間ポイントで引き込まれる樹状の先端を示し、小さな白い矢印は隣接するセルの軸索を示します。4.5時間後、青い矢印を持つ樹状の先端が引き込まれ、黄色の矢印を持つ樹状の先端が細長くします。代表的な樹状形態再構成がここに示され、ここで見られる切断された樹状突起を示すニューロンは、分析から除外されるべきである。
この手順を試みる間は、プロセス中に硬膜をそのままにしておくことが重要です。この手順を用いて、推進画像化のような他の方法は、新生児脳におけるニューロン活動パターンに関連する追加の質問に答えるために行うことができる。
