1。楽器のセットアップ<ol><li>蛍光分光光度計の電源を入れ、1時間ウォームアップ。 </li><li> Excelは、図1に示すように、標準およびサンプルデータを持つファイルを作成し、そのコンマで区切られた値&quot;CSV&quot;形式で保存する方法。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。スタンダードとサンプルデータ。 </li><li>次のように蛍光光度計を設定します。 <ol><li>をクリックしてください<img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="アイコン1" />ボタン、これは図2に示すように解析手法のウィンドウが、開きます。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。分析法のウィンドウ、[全般]タブ。 次のように選択します。 <ul><li> &quot;測定&quot;フィールドで、プルダウンメニューから測光を選択します。 </li><li> &quot;オペレータ&quot;フィールドで、適切な演算子の名前を入力します。 </li><li> &quot;インストゥルメント&quot;フィールドに情報を入力する必要はありません。これは、ソフトウェアによって自動的に選択されます。 </li><li>マイクロプレートリーダーを使用する場合は&quot;サンプリング&quot;フィールドは非アクティブです。 </li><li>あなたが&quot;コメント&quot;フィールドに、レポートに含めることができる任意のコメントを入力してください。 </li><li> &quot;アクセサリー&quot;フィールドに、このテストのために使用されるアクセサリーに関連する情報を入力してください。 </li><li>ウィンドウの右側のボタンに注意してください。 </li><li> &quot;読み込み&quot;ボタンをクリックすると、以前に保存された分析メソッドをロードすることができます。 </li><li> &quot;Save&quot;ボタンは、同じ名前を使用して、以前に保存し、ロードテストパラメータや解析手法のセットを更新できます。 </li><li>ボタンは任意の名前の下に、テストパラメータや解析手法の新しいセットを保存できる&quot;名前を付けて保存&quot;。 </li></ul> 今、&quot;定量化&quot;タブをクリックします（図3参照）と次の選択を行います。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。分析法の窓、定量タブ。 <ul><li> &quot;定量のタイプ&quot;フィールドでは、波長を選択します。これは、蛍光読み取りが選択された波長を使用して行われることを示します。 </li><li> &quot;キャリブレーションのタイプ&quot;フィールドで、1回目の順番を選択します。 </li><li> &quot;波長の数&quot;フィールドに、1を選択します。 </li><li> &quot;濃度の単位&quot;フィールドで、ng / mLを入力してください。 </li><li> &quot;マニュアルキャリブレーション&quot;と&quot;ゼロを介してフォースカーブ&quot;のチェックボックスを選択しないままにします。 </li><li>フィールド&quot;小数点以下の桁&quot;で、2を選択します。 </li><li> &quot;低濃度の上限&quot;フィールドで、0を入力します。 </li><li> &quot;アッパー濃度限界のフィールドでは、10000を入力します。 </li></ul> 今すぐ&quot;インストゥルメント&quot;タブをクリックし、次の選択を行います。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。分析法のウィンドウ、インストゥルメント]タブ <ul><li> &quot;データモード：&quot;フィールドで、蛍光を選択します。 </li><li> &quot;チョッピング速度&quot;フィールドはこの時点で非アクティブになって、それはリン光測定のためにのみ使用されます。 </li><li> &quot;波長モード&quot;フィールドでは、どちらのWLの固定]を選択します。 </li><li> &quot;EX / WL1&quot;フィールドに480nmと入力します。 </li><li> &quot;EM / WL1&quot;フィールドでは520nmを入力してください。 </li><li>他のすべてのEXの下のフィールドとEMはこの時点で非アクティブです。 </li><li> &quot;EXスリット&quot;フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。 </li><li> &quot;EMスリット&quot;フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。 </li><li> &quot;PMT電圧1 - 1000V&quot;フィールドの前にあるボックスを選択しないままにします。 </li><li> &quot;PMT電圧&quot;フィールドで、プルダウンメニューから700Vを選択します。 </li><li>の&quot;自動統計のcalc。番号&quot;フィールドを選択します2。 </li><li> &quot;レプリケート&quot;フィールドで1を選択します。 </li><li> &quot;積分時間&quot;フィールドでは0.1秒を選択します。&lt;/ LI&gt; <li> &quot;遅延&quot;フィールドに入力するか、または0を選択します。 </li></ul> &quot;モニタ&quot;タブをクリックします。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。分析法のウィンドウ、[モニタ]タブ。 <ul><li>フィールドを選択10000：&quot;Y軸&quot;、&quot;マックス&quot;の</li><li> &quot;Y軸&quot;で、&quot;最小：&quot;フィールド、0を選択します。 </li><li> &quot;データ収集後のオープンデータの処理&quot;の左側にあるボックスを選択します。 </li><li>もし測定値が完了した後に自動的に印刷するレポートを必要とする場合を除き、&quot;データ取得後のレポート印刷&quot;の左にあるボックスを選択しないままにします。 </li></ul> &quot;レポート&quot;タブをクリックし、図6を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。分析法のウィンドウ、レポートタブ。 <ul><li> &quot;出力&quot;フィールドで、プルダウンメニューからレポートの印刷]を選択します。また、カスタムメイドのレポートを生成できるようにするプログラムのレポート生成プログラムで、オプションのアドインを使用する場合は、&quot;印刷ジェネレータシートを使用して、&quot;Excelにエクスポートされたデータが必要な場合は、&quot;Microsoft Excelを使用する&quot;、または選択することもできます。 </li><li>レポートに含まれるようにしたい項目のチェックボックスをクリックしてください。 </li><li> &quot;分析方法&quot;ウィンドウの別のタブで選択されたすべてのパラメータを保存するには、&quot;&quot;全般&quot;タブを再度クリックし、ファイル名の下にし、将来の使用のためにそれらを見つけるような場所に保存し、クリックします。 OK&quot;このウィンドウを閉じるためのボタン。 </li><li>これにより、機器の試験パラメータの設定は完了です。 </li><li>今我々はマイクロプレートリーダーを設定します。 </li><li>をクリックしてください<img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="アイコン[2]" />上にMPR Setupウィンドウをもたらすボタン、。 </li></ul> 図7に示すように、MPR設定画面/プレートタブの標準とサンプルのための井戸を、選択してください。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。 MPR Setupウィンドウ、プレートタブ。 <ul><li> A1の位置をクリックして、E1にマウスをドラッグし、次にをクリックしてください<img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="アイコン3" />ボタン。これは、標準に使用される位置を選択します。それらの位置は、緑の色で強調表示されます。 </li><li>今、私たちは、サンプルのH3にF1の位置を選択する必要があります。をクリックしてクリックし、位置のF1で起動するマウスをドラッグして、H3の位置をすると<img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="アイコン4" />ボタン、これは黄色の色でそれらの位置が強調表示されます。 </li><li>その後、サンプルの測定のためのそれらの位置を選択するには、E3にA2の位置に対して同じ操作を繰り返します。 </li><li>今、標準とサンプルの情報と予め用意された変数（CSV）ファイル区切りファイルのカンマをロードしてみましょう。 </li></ul> 図8に示すように、&quot;MPR Setup]ウィンドウ&quot;、の&quot;まあ情報&quot;タブをクリックします。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="図8" /> 図8。 MPR Setupウィンドウ、きちんとした情報]タブ。 <ul><li>次にをクリックしてください<img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="アイコン5" />ボタン。 Windowsエクスプローラのウィンドウには、&quot;まあinformation.csv&quot;ファイルを探し、それをロードできるようになりますれ、図9に示すように、どのように表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="図9" /> 図9。サンプルウェルの情報をロード。 &quot;まあ情報&quot;ファイルをロードした後、&quot;まあ情報は、&quot;図10に示すようになります <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="図10" /> 図10。サンプルも情報をロードしました。 </li></ul></li></ol></li></ol> 2。 Picogreenアッセイサンプルの準備<ol><li> 20 × TEバッファー1mlを加えることによって1 × TEバッファー（10mMトリス- HCl、1mMのEDTA）を準備〜19 mLののdI H 2 O </li><li> 9.95 mLの1 × TEバッファーに50μlの200 X PicoGreen試薬を添加することによりPicoGreen試薬溶液を準備します。 </li><li>株式鎖DNA（100μg/ mLの）の段階希釈を行うことによって基準（ラムダdsDNAを）準備する。最初の株式のdsDNA（100μg/ mL）を、25μLの1 × TEバッファー25μLを加えることによって50μg/ mlのdsDNAの溶液を調製。次に、以下の表に示すように二本鎖DNAとバッファの指定されたボリュームを追加することによって、標準溶液を調製。 <table border="1"><tbody><tr><td> dsDNAの濃度</td><td> dsDNAの体積</td><td> Bufferの量</td></tr><tr><td> 1μg/ mlの</td><td> 50μg/ mlのdsDNAの20μL </td><td> 980μLの1 × TEバッファー</td></tr><tr><td>は0.1μg/ mLの</td><td> 1μg/ mlのdsDNAの100μL </td><td> 900μL1 X TEバッファー</td></tr><tr><td> 0.01μg/ mLの</td><td>は0.1μg/ mLのdsDNAの100μL </td><td> 900μL1 X TEバッファー</td></tr><tr><td> 0.001μg/ mLの</td><td> 0.01μg/ mLのdsDNAの100μL </td><td> 900μL1 X TEバッファー</td></tr></tbody></table></li></ol> 3。スタンダードとサンプルの蛍光の測定<ol><li>ピペット150 96ウェルプレートのウェルA1 - E1にそれぞれ標準のμL、図7に当たり、および次の表によると： <table border="1"><tbody><tr><td>も</td><td>標準的な</td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1μg/ mlの</td></tr><tr><td> B1 </td><td>は0.1μg/ mLの</td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01μg/ mLの</td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0.001μg/ mLの</td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TEバッファー</td></tr></tbody></table></li><li>図7に示すように、H3に井戸F1ピペット150μLの未知試料、 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用するように設計された溝にステップ1.2で作成したPicoGreenソリューションを注ぐ。井戸A1 - H3〜150μLPicoGreenソリューションを提供するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。静かにピペットで混合液と標準。 </li><li>場所は、暗い領域でプレートと開発するために反応のために2〜5分待ちます。 </li></ol> 4。代表的な結果良好な検量線は、ソフトウェアによる検量線の基準と計算の測定時にF - 7000のソフトウェアが提供する様々なパラメータを用いて評価されます。 決定係数は、測定基準の適合度と計算された検量線を示します。近いこの値は測定値と検量線のフィットより、&quot;1&quot;になります。 値が&quot;1&quot;から離れている場合、基準は、再測定を再度準備、または検量線のフィットネスは、変更する必要があります。 図11は、PicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化のために得られる計算された決定係数= 0.99993、と検量線の例を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="図11" /> 図11。本鎖DNAの検量線の例。

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li></ol>

ルイスA.モレノとケンドラL.コックスは、この記事で使用する機器を生産する（株）日立ハイテクノロジーズアメリカで採用されています。

慎重な試料調製時のピペッティングだけでなく、安定かつ高感度蛍光分光光度計を使用しては良いと再現性のある結果を得るために不可欠です。 このテストで使用される蛍光分光光度計の場合には、それをマイクロプレートリーダーで300μL最終的なサンプル量を使用して提案されている。下のボリュームは感度を低下させ、より大きなボリュームでは、ウェル間のクロスコンタミネーションを引き起こす可能性があります。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Distilled H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>237108</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 Channel Eppendorf Micropipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3516677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000 &mu;L Eppendorf Pipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>200 &mu;L Eppendorf Pipette </td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL serological pipet</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette tips</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J1-0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microplate Reader Accessory for F-7000</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J0-0139</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of dsdna using the hitachi f-7000 fluorescence spectrophotometer and picogreen dye

特に低濃度のDNAの定量化は、合成および精製DNAの、このようなDNA増幅産物の定量化などの診断アプリケーション、および薬剤のDNA分子の検出などの標準的な分子生物学的アッセイを含む生物学的用途の広い範囲で重要な課題である準備。このビデオの間に我々は、分子プローブクワント - それPicoGreen色素試薬キットを用いて二本鎖DNAの定量を行うためにマイクロプレートリーダーアクセサリを装備した日立F - 7000蛍光分光光度計の機能のデモンストレーションを行います。 F - 7000蛍光分光光度計は、高感度と高速測定を提供しています。それは、蛍光、発光、および燐光を測定することができる柔軟性の高いシステムです。いくつかの測定モードは波長スキャン、時間のスキャン、測光と3次元スキャン測定を含めて、利用可能です。分光光度計は、マイクロプレートに300μLサンプル量を使用する場合はフルオレセインの50ピコモルの範囲で感度を有し、および60,000 nm /分のスキャン速度を測定することができます。また、濃度の広い範囲で検量線の使用を可能にする5桁までの広いダイナミックレンジを持っています。光学系は、最大エネルギーと感度のすべての反射光学系を使用しています。標準的な波長範囲は200〜750nmのであり、そしてオプションの近赤外光電子増倍管のいずれかを使用するときに900nmのように拡張することができます。システムは、オプションの外部温度制御された液体循環装置を使用して摂氏5〜60度からプレートリーダー用のオプションの温度制御が可能になります。マイクロプレートリーダーは、96ウェルマイクロプレートの使用を可能にする、と動力学のモードを使用する場合は96ウェルの測定速度は60秒未満です。 F - 7000とマイクロプレートリーダーのためのソフトウェアのコントロールも非常に柔軟です。サンプルは、列または行の形式のいずれかで設定でき、井戸の任意の組み合わせは、サンプル測定用に選択される可能性があります。これは、マイクロプレートの最適な利用が可能になります。さらに、ソフトウェアはマイクロプレートのサンプル構成Excelで作成し、カンマで区切られた値に保存されている、または&quot;CSV&quot;形式をインポートできます。マイクロプレート測定の設定が保存され、利便性のためのソフトウェアと生産性の向上によって呼び出すことができます。データの結果は、標準レポートには、Excelに、または任意のレポート生成プログラムに出力することができます。

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Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

分子プローブPicoGreen色素とマイクロプレートリーダーアクセサリを装備した日立F - 7000蛍光分光光度計を使用してdsDNAの定量化のデモンストレーション。

日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

24.4K ビュー.  Hitachi High Technologies America. 分子プローブPicoGreen色素とマイクロプレートリーダーアクセサリを装備した日立F - 7000蛍光分光光度計を使用してdsDNAの定量化のデモンストレーション。

ビデオ: Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

粉末試料の絶対量子収率測定

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods are essential to provide critical insights into these thermogenic adipose depots. Here, the protocol presents a PET/MR imaging-based method to evaluate the activity of brown and beige adipocytes in mouse interscapular brown adipose tissue (iBAT) and inguinal subcutaneous white adipose tissue (iWAT). Visualization and quantification of the thermogenic adipose depots were achieved using [18F]FDG, the non-metabolizable glucose analog, as the radiotracer, when combined with the precise anatomical information provided by MR imaging. The PET/MR imaging was conducted 7 days after cold acclimation and quantitation of [18F]FDG signal in different adipose depots was conducted to assess the relative mobilization of thermogenic adipose tissues. Removal of iBAT substantially increased cold-evoked [18F]FDG uptake in iWAT of the mice.

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Functional imaging and quantitation of thermogenic adipose depots in mice using a micro-PET/MR imaging-based approach.

[18F]FDGマイクロPET/MRイメージングを用いたマウスの褐色およびベージュ色の脂肪組織の可視化と定量化

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...