The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

注意：このプロトコルの液滴は、既存の商業用の液滴メーカー23,29を形成することができるように、マイクロ流体デバイスを製造することは、このアッセイのために必要ではありません。 1.液滴形成マイクロ流体デバイスを作ります<ol><li>以前に31が、液滴発生器のマスクパターン32と概説SU-8マスター製作プロトコルチャネルのためのマスターモールドを準備します。 </li><li>ソフトリソグラフィ32,33の技術を使用して、PDMS内のデバイスを製造します。 </li></ol> 2.バルク液滴読み出し用の反応ミックスを調製します 注意：このプロトコルは、増幅反応の多くのタイプを使用して、核酸を定量するために使用することができます。一例として、いくつかのラムダDNA濃度のMDAのために必要な試薬が挙げられます。試薬の詳細は特定の試薬の表に記載されています。液滴内のテンプレートの配布はsufficienに依存サンプルのトン混合。 <ol><li>取得またはPurifyのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 <ol><li>以前サプライヤーから7、または購入を説明するようにファージPhi29を精製します。示される実験に使用されるフ​​ァージPhi29を精製しました。 </li></ol></li><li> 65 mMのKOH、1.65 mMのEDTA、及び14 mMのDTTからなる変性緩衝液10mlを準備します。 </li><li> 65 mMのHClを、0.21 Mトリス-Cl pH7.0の、および9 mMのトリス-Cl pH8.0のからなる中和緩衝液10mlを準備します。 </li><li>このようなヌクレアーゼフリー水のような2つの規格、1テンプレートを含まないコントロール（NTC）、および1つの高鋳型濃度（4 PG周り/μlのラムダDNA）を準備します。定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの各標準の3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLで各クエンチ。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの関心のテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。 3.3μlのクエンチ中和バッファーの。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2X MDA反応マスター混合物を2×二本鎖DNA（dsDNA）結合色素、2倍のqPCR参照色素、オリゴランダム化50μM、2 mg / mlのBSA、2×ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼを含まない水で構成され、および40 / mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。ファージPhi29 DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼがよく7.5.Mixよりもはるかに高いまたは低いpHレベルが発生しないようするために、最後の追加します。 </li><li>オプション：少ない偽陽性の場合は、事前の液滴34を形成する UV光でマスターミックスを公開します。 <ol><li>氷上で0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットル明確なチューブにサンプルあたりの予備混合物の10μlのを準備します。プレミックスは、55μMの無作為化オリゴ、2.2 mg / mlのBSA、1.1倍ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー、5.3 mMのdNTP類、およびヌクレアーゼフリー水で構成されています。 </li><li> 34に記載されているように氷の上に水の中にチューブを置き、ACCUに、UV光（254nm）に公開5.7 J / cm 2のmulated用量。 </li><li>予備混合物中に40μgの/ mlに二本鎖DNA結合1Xに染料、1Xに参照色素、およびファージPhi29を追加します。よく混ぜます。 </li></ol></li><li>変性テンプレートまたは標準10μlのマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li></ol> 3.液滴形成注液滴が静電気やせん断応力に対して非常に敏感であることができます。静電気が発生する可能性があり衣服を削除して、液滴を形成する前に、身体を接地してください。できるだけエマルジョンから、管の上部からエマルジョンのチューブを処理します。非常にゆっくりとピペットエマルジョン、好ましくはワイドボアピペットチップと。ピペットチップから分配する場合には、分注速度を決定するために、先端の側面にエマルションを見ます。 <ol><li>フォーム滴。示される実験では、マイクロ流体デバイスは、オイル入口と液滴を生成するためのフローフォーカシングジャンクショ​​ンの2つの水の入口があります。 2シリを使用してくださいNGE 20,000 1 NL液滴を生成するために、マイクロ流体チップを介して界面活性剤と油の55μlの反応混合物の20マイクロリットルの流量を制御するためのポンプ。 </li><li>注：これは、界面活性剤と油の多くの種類の液滴を生成することが可能であるが、組成物は、非常に高温で、経時安定性、液滴に影響を与えます。一つの可能な組み合わせは、陰イオン界面活性剤19,35とフッ素系オイルのHFE 7500です。 </li><li>いずれかの方法13,36との任意のサイズで液滴を生成するが、液滴集団内のサイズの変動は、バルク蛍光ため、アッセイの精度に影響します。示される実験では、液滴は1 NLの量で単分散しました。 </li><li> PCRチューブに液滴とオイルのすべてを収集します。各サンプルについて、光学キャップと新鮮なPCRチューブに一定分量の油の30μLを、オイルの上に液滴を20μlを移します。一貫性のあるボリュームは、アッセイは、交流としてであることを確認しますできるだけキュレーション。 </li><li>閉じるチューブのキャップをしっかりと、ルーズキャップは、油が蒸発することができます。 </li></ol> 4.等温増幅<ol><li> PCRサーモサイクラー、定量PCRサーモサイクラー、またはホットプレートを用いて、7時間、30℃でサンプルをインキュベートし、そして75℃で1分間の不活性化。液滴のチューブは、この時点で数時間ホイルで覆い、冷蔵庫に放置することができます。 </li></ol> 5.データ収集と分析<ol><li>直ちに反応不活性化の後、定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべての試料について、色素の蛍光レベルを測定します。最適フィルタの設定は、色素の励起および発光スペクトルに依存するであろう。この例では、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。他の蛍光測定技術は、蛍光を定量化するために使用することができます。 </li><li>各サンプルについて、によって二本鎖DNA結合色素の蛍光強度を分割参照色素の蛍光強度。すべてのサンプルから、バックグラウンド蛍光、または全くテンプレートコントロールの正規化された蛍光を引きます。 </li><li>標準から補正された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。 NTC標準は0％、蛍光滴（「すべて陰性」）、および高鋳型濃度の蛍光測定したサンプルについての蛍光を表す（「すべての正」）の100％蛍光液滴を有する試料の予想蛍光です。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li></ol> 6.生産液滴実証の原理測定のための<ol><li>蛍光（正）の液滴を作る：0.1 ngのラムダDNA、1×二本鎖DNA結合色素、1X参照色素​​、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5メートルからなるPCR反応液を調製MのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、および0.5μMのプライマー。上記のように混合物を30時間（20秒、20秒、1分間72°C、55°C、95°C）熱サイクルは、液滴を形成します。 </li><li>メイク非蛍光（陰性）小滴：1XのdsDNA結合色素、1X参照色素、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、からなるPCR反応混合物を調製しますおよび0.5μMのプライマー。混合物を30時間（20秒95℃、20秒、1分間72°C、55°C）は、その後の液滴を形成する熱サイクル。 </li><li>プレミックスの液滴の比率を形成<ol><li>定量PCRチューブにフッ素系オイルを20μlを配布し、蒸発を防ぐため、光学キャップでカバーしています。 </li><li>油の上に負の比：優しく希望正でよく混合液滴の10μLをピペット。示された結果では、正：負の液滴比は1（すべて正）、0.8、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001、0（すべて陰性でしたative）。 </li></ol></li><li>定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべてのサンプルについて、色素の蛍光レベルを測定します。このプロトコルでは、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。 <ol><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、「すべての陽性」のサンプルの蛍光によって正規化します。 </li></ol></li><li> 「すべての正」と「すべての否定」のサンプルから正規化された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li><li>各比率（n = 3）を独立した液滴の形成と各反復のために混合しながらのための実験を​​繰り返します。 </li></ol> 7.実証の原理MDA実験<ol><li>スペックでラムダDNAストック溶液の濃度を測定しますtrophotometer。 <ol><li> 1滴あたり平均10テンプレート分子に必要なテンプレートの濃度を計算します。このプロトコルでは、液滴体積は1 NLとラムダDNAを1 ngのは、約1.9×10 7コピーが含まれていると仮定します。そのため、1滴あたり10テンプレートはNLあたり10コピー、または1μl当たり526 FGラムダDNAとなります。テンプレートには、液滴が形成されている場合〜6倍、したがって、初期最高テンプレート濃度が3.2 PG /μLになる希釈化することになります。 </li></ol></li><li>逐次変性バッファーと同体積の中和バッファー3.2 PG /μlにラムダDNAを希釈します。 0.1の希釈率は、変性バッファーの45μlの10μlのサンプルを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。クエンチするために中和バッファーの45 LLを追加します。 </li><li>実験用サンプルの残りの部分を作るためにステップ7.2で説明したように、試料を希釈します。示す反応における初期鋳型濃度は、3.2 PG、320 FGました160 FG、32 FG、16 FG、3.2 FG、およびマイクロリットル当たり1.6 FG。 注意：マスターミックスの添加後の最終的なテンプレート濃度は526 FGた、52.6 FG、26.3 FG、5.26 FG、マイクロリットル当たり2.63 FG、526社、263社。 10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、およびそれぞれ1滴あたり0.005期待ラムダコピー。 </li><li>生成し、ステップ2.5から5.3に記載されているように、各サンプルからの液滴を分析します。 </li><li>デジタルカメラを使用して示す蛍光画像（ 図2,3）は、室温で10倍の対物レンズと落射蛍光顕微鏡に取り付けられ得ます。各サンプルのビューの12のフィールドを取得します。蛍光スライドを用いて得られた背景画像で補正蛍光画像。 </li><li>エマルジ ​​ョンオイルはすぐに蒸発するように、撮像37に含まれるチャンバーを使用してください。 </li><li> ImageJのマクロ（補足コードファイル）を使用して、個々の液滴の強度を分析します。 <ol><li>最高のNに非蛍光滴を分離する閾値蛍光強度を選択します高濃度のテンプレート画像内の蛍光液滴からTCの画像。各未知試料について、閾値より上の蛍光強度との液滴の割合を計算します。 </li></ol></li></ol> 8. PCRおよびMDAバルク反応<ol><li> PCR反応を準備します。 <ol><li>直列0.1の希釈率で鋳型DNAを希釈します。各希釈のために、変性緩衝液45μlのテンプレートを10μlを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの45μlの希釈を組み合わせます。 </li><li>サンプルあたりのPCRマスターミックス20μlのを準備します。 1.1倍PCR反応マスター混合物は、60単位/μlのTaq DNAポリメラーゼ、11mMのトリス-HCl、55ミリメートルのKCl、1.65ミリモルのMgCl 2、0.22 mMのdNTPを、1.1倍のdsDNA結合色素、1.1倍の参照色素、および550nmの成り各プライマー。 </li><li>希釈されたテンプレートを2μlとマスターミックス20μlのを兼ね備えています。 注意：最後の鋳型濃度トンで彼が示したPCR反応50頁、5頁、500 FG、マイクロリットル当たり50 FG、5 FG、500社、および0グラムラムダDNAたし、三連で行いました。 </li><li>以下のプログラムでのqPCR機における熱サイクルのPCR反応。 2分間72℃で2分間前に30秒、30秒、20秒57℃、72℃、95℃の40サイクルを実行し、4℃で保持します。 </li><li>二本鎖DNAは、更なる分析の前に参照色素蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。 </li></ol></li><li> MDA反応を準備します。 <ol><li>ステップ8.1.1で説明したようにサンプルを希釈します。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2倍MDA反応マスター混合物は、2倍のdsDNA結合色素、2倍のリファレンス色素、オリゴランダム化、50μM、2 mg / mlのBSA、2倍のファージphi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼフリー水、および40 / mlのから成りファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 </li><li>ポリメラーゼdを確保するために、最後の40μg/ mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼを追加OESは、7.5よりもはるかに高いまたは低いpHレベルは発生しませ。よく混ぜます。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの希釈したテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLを加えます。 </li><li>変性テンプレートの10μLとマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li><li>以下のプログラムで定量PCR機にMDA反応を実行します。 </li><li> 4時間30℃で保持し、蛍光ごとに7.5分を測定します。 </li><li> 1分間75℃で不活性化します。 </li><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、各サンプルの最大蛍光により正規化します。 </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

デジタルアッセイは、希少細胞の検出、および核酸分子の個々のカウントを可能にする強力な方法です。しかし、デジタルのアッセイは、まだ日常的に市販されている方法に関連する特殊な装置のコストを部分的には、分析ラボで適用によるものではありません。ここでは、標準的なリアルタイム定量PCR装置を用いて簡略化したアナログ読み出しと核酸を定量するためのエンドポイントのデ?...

核酸定量化（デジタルPCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。 過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。 WGA反応6の高収量は、単一分子7、単セル8および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル9からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連する主要な課題は、その汚染物質に対する極端な感度、個々のテンプレート分子6全体で不均一に増幅しています。 WGAによってWGA技術10の「キラーアプリケーション」、およびテンプレートの定量化は、アプリケーション7の多くの分野で重要であるように、単一のセルの順序が浮上しているようしかし、WGAが人気を集めています。 デジタル核酸定量化のための計測は、以前バルブ付きとバルブレスマイクロ流体フォーマのさまざまに記載されています小滴ベースのアッセイを含むTS 11-14、15,16（ 表2）。しかし、デジタル解析用の市販のマイクロ流体システムは、反応のセットアップと製品の検出に特化した17の機器を必要とします。カスタムバルブ付きマイクロフルイディクスは、柔軟であるが、高精度の微細加工と空気圧制御システム18が必要です 。それは、エマルジ ​​ョンベースのデジタルアッセイ19,20のために単分散の微小液滴を作ることは比較的簡単であるが、デジタル読み出しは、（人気の次世代配列決定技術に類似）のいずれかの大規模な広視野イメージング21,22を必要とする 、技術的に厄介であるか、または高速フローベースの滴検出23-25。理想的には、デジタル分析は、複雑な器具類の必要性を低減し、多数のサンプルを迅速に読み出すことができるように、読み出しにセットアップから簡単になります。ここでは、従来のリアルタイムPCR Iを使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を説明しますnstrumentは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定しました。 新しいアプローチは、デジタルPCRアッセイに適用することができるが、それは、（PCRのための優れた結果を与える）問題とリアルタイム増幅アッセイアナログれるデジタルWGAアッセイに特に有利です。 WGAは、一般的に、配列、長さ、及びベース含有量の不均一であるテンプレート分子にサンプルに適用されます。これらの異なる鋳型分子は、整合特性を有する参照（「標準」）のサンプルの使用を必要とする、異なる速度6で増幅されています。多くの場合、そのような標準が利用できない、または入ってくるサンプルの特性は不明です。入力された質量、分子の入力番号、2つ、またはいずれの組み合わせを-入力された材料の不均一性及びWGA化学の長さに依存する特性26はまた、定量化されているもので曖昧さを作成することによって、結果の解釈を複雑にします。 F任意の配列の汚染物質の分子が妨害する可能性があるためinally、配列非特異性は、定量的PCRよりも汚染に敏感定量的な複数置換増幅（MDA）をレンダリングします。マイクロ流体デジタルアッセイは、鋳型分子を分離し、より少ない汚染物質がサンプリングされるように、反応体積を減らすことによって、汚染に対処します。 ここでは、人気の等温WGA法、MDA 27を使用します 。注目すべきは、PicoPlexとMALBAC 28を含むいくつかの他のWGA化学は初期等温鎖置換手順に決定的に依存しています。等温ステップは、定量的WGAするアナログリアルタイムアッセイを適用する挑戦を悪化させます。 WGAは完全に不要な変数プレ増幅につながる、セットアップ中に防止なく、また離散化もできない（「循環」）異種の分子の複製が完了するまで駆動し、PCR前11のように、次のサイクルに停止することができる方法で、 </suP&gt;（ 図1）。 WGAのためのデジタルアッセイ形式は、（そのように前増幅は、結果には影響しません）アッセイエンドポイントでの列挙のための各分子の分離に起因する典型的な反応セットアップ手順をaccomodates元の読み出しが精度が増幅効率の変動に大きく依存することになることを意味します。 アッセイエンドポイントでの1滴あたりの信号レベルは液滴量に依存することになるようアッセイは、均一な体積で油中に生成される液滴に依存しており、我々は結果の一貫性は、液滴サイズの分布全体に平均化に依存する必要はありません。単分散液滴を作ることになりました（約​​3,500単分散液滴の論文は2013年以降に発行された）標準的な手順ですが、マイクロ流体計測器25を必要とします 。実際には、以上の6社は、このような液滴の生産に依存している独立した商用製品を開発している、と液滴作りのマイクロ流体チップは、23,29市販。この研究のために、私たちは内製のカスタムマイクロ流体デバイスを（プロトコルを参照）を使用しました。デバイスを通る流れを駆動するためのシリンジポンプはまた、市販されているが、代替的に、コストを削減する30真空駆動流のための単一の使い捨て注射器で置換することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。 私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。 我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。

従来のバルク/リアルタイム読み出し定量PCRおよび定量WGAアッセイ（ 図1）の両方に使用することができるが、デジタル定量的アッセイは、利点がある （表1）を提供します 。記載された方法では、単純なバルクエンドポイント測定（ 図2）を用いて、マイクロ液滴形式のデジタル分析を読み出します。この方法は広く適用可能であるが、この...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K ビュー.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

生物学

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNAを有する核酸構造の分析と構築

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...