Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

注意：このプロトコルの液滴は、既存の商業用の液滴メーカー23,29を形成することができるように、マイクロ流体デバイスを製造することは、このアッセイのために必要ではありません。 1.液滴形成マイクロ流体デバイスを作ります<ol><li>以前に31が、液滴発生器のマスクパターン32と概説SU-8マスター製作プロトコルチャネルのためのマスターモールドを準備します。 </li><li>ソフトリソグラフィ32,33の技術を使用して、PDMS内のデバイスを製造します。 </li></ol> 2.バルク液滴読み出し用の反応ミックスを調製します 注意：このプロトコルは、増幅反応の多くのタイプを使用して、核酸を定量するために使用することができます。一例として、いくつかのラムダDNA濃度のMDAのために必要な試薬が挙げられます。試薬の詳細は特定の試薬の表に記載されています。液滴内のテンプレートの配布はsufficienに依存サンプルのトン混合。 <ol><li>取得またはPurifyのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 <ol><li>以前サプライヤーから7、または購入を説明するようにファージPhi29を精製します。示される実験に使用されるフ​​ァージPhi29を精製しました。 </li></ol></li><li> 65 mMのKOH、1.65 mMのEDTA、及び14 mMのDTTからなる変性緩衝液10mlを準備します。 </li><li> 65 mMのHClを、0.21 Mトリス-Cl pH7.0の、および9 mMのトリス-Cl pH8.0のからなる中和緩衝液10mlを準備します。 </li><li>このようなヌクレアーゼフリー水のような2つの規格、1テンプレートを含まないコントロール（NTC）、および1つの高鋳型濃度（4 PG周り/μlのラムダDNA）を準備します。定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの各標準の3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLで各クエンチ。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの関心のテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。 3.3μlのクエンチ中和バッファーの。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2X MDA反応マスター混合物を2×二本鎖DNA（dsDNA）結合色素、2倍のqPCR参照色素、オリゴランダム化50μM、2 mg / mlのBSA、2×ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼを含まない水で構成され、および40 / mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。ファージPhi29 DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼがよく7.5.Mixよりもはるかに高いまたは低いpHレベルが発生しないようするために、最後の追加します。 </li><li>オプション：少ない偽陽性の場合は、事前の液滴34を形成する UV光でマスターミックスを公開します。 <ol><li>氷上で0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットル明確なチューブにサンプルあたりの予備混合物の10μlのを準備します。プレミックスは、55μMの無作為化オリゴ、2.2 mg / mlのBSA、1.1倍ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー、5.3 mMのdNTP類、およびヌクレアーゼフリー水で構成されています。 </li><li> 34に記載されているように氷の上に水の中にチューブを置き、ACCUに、UV光（254nm）に公開5.7 J / cm 2のmulated用量。 </li><li>予備混合物中に40μgの/ mlに二本鎖DNA結合1Xに染料、1Xに参照色素、およびファージPhi29を追加します。よく混ぜます。 </li></ol></li><li>変性テンプレートまたは標準10μlのマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li></ol> 3.液滴形成注液滴が静電気やせん断応力に対して非常に敏感であることができます。静電気が発生する可能性があり衣服を削除して、液滴を形成する前に、身体を接地してください。できるだけエマルジョンから、管の上部からエマルジョンのチューブを処理します。非常にゆっくりとピペットエマルジョン、好ましくはワイドボアピペットチップと。ピペットチップから分配する場合には、分注速度を決定するために、先端の側面にエマルションを見ます。 <ol><li>フォーム滴。示される実験では、マイクロ流体デバイスは、オイル入口と液滴を生成するためのフローフォーカシングジャンクショ​​ンの2つの水の入口があります。 2シリを使用してくださいNGE 20,000 1 NL液滴を生成するために、マイクロ流体チップを介して界面活性剤と油の55μlの反応混合物の20マイクロリットルの流量を制御するためのポンプ。 </li><li>注：これは、界面活性剤と油の多くの種類の液滴を生成することが可能であるが、組成物は、非常に高温で、経時安定性、液滴に影響を与えます。一つの可能な組み合わせは、陰イオン界面活性剤19,35とフッ素系オイルのHFE 7500です。 </li><li>いずれかの方法13,36との任意のサイズで液滴を生成するが、液滴集団内のサイズの変動は、バルク蛍光ため、アッセイの精度に影響します。示される実験では、液滴は1 NLの量で単分散しました。 </li><li> PCRチューブに液滴とオイルのすべてを収集します。各サンプルについて、光学キャップと新鮮なPCRチューブに一定分量の油の30μLを、オイルの上に液滴を20μlを移します。一貫性のあるボリュームは、アッセイは、交流としてであることを確認しますできるだけキュレーション。 </li><li>閉じるチューブのキャップをしっかりと、ルーズキャップは、油が蒸発することができます。 </li></ol> 4.等温増幅<ol><li> PCRサーモサイクラー、定量PCRサーモサイクラー、またはホットプレートを用いて、7時間、30℃でサンプルをインキュベートし、そして75℃で1分間の不活性化。液滴のチューブは、この時点で数時間ホイルで覆い、冷蔵庫に放置することができます。 </li></ol> 5.データ収集と分析<ol><li>直ちに反応不活性化の後、定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべての試料について、色素の蛍光レベルを測定します。最適フィルタの設定は、色素の励起および発光スペクトルに依存するであろう。この例では、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。他の蛍光測定技術は、蛍光を定量化するために使用することができます。 </li><li>各サンプルについて、によって二本鎖DNA結合色素の蛍光強度を分割参照色素の蛍光強度。すべてのサンプルから、バックグラウンド蛍光、または全くテンプレートコントロールの正規化された蛍光を引きます。 </li><li>標準から補正された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。 NTC標準は0％、蛍光滴（「すべて陰性」）、および高鋳型濃度の蛍光測定したサンプルについての蛍光を表す（「すべての正」）の100％蛍光液滴を有する試料の予想蛍光です。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li></ol> 6.生産液滴実証の原理測定のための<ol><li>蛍光（正）の液滴を作る：0.1 ngのラムダDNA、1×二本鎖DNA結合色素、1X参照色素​​、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5メートルからなるPCR反応液を調製MのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、および0.5μMのプライマー。上記のように混合物を30時間（20秒、20秒、1分間72°C、55°C、95°C）熱サイクルは、液滴を形成します。 </li><li>メイク非蛍光（陰性）小滴：1XのdsDNA結合色素、1X参照色素、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、からなるPCR反応混合物を調製しますおよび0.5μMのプライマー。混合物を30時間（20秒95℃、20秒、1分間72°C、55°C）は、その後の液滴を形成する熱サイクル。 </li><li>プレミックスの液滴の比率を形成<ol><li>定量PCRチューブにフッ素系オイルを20μlを配布し、蒸発を防ぐため、光学キャップでカバーしています。 </li><li>油の上に負の比：優しく希望正でよく混合液滴の10μLをピペット。示された結果では、正：負の液滴比は1（すべて正）、0.8、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001、0（すべて陰性でしたative）。 </li></ol></li><li>定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべてのサンプルについて、色素の蛍光レベルを測定します。このプロトコルでは、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。 <ol><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、「すべての陽性」のサンプルの蛍光によって正規化します。 </li></ol></li><li> 「すべての正」と「すべての否定」のサンプルから正規化された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li><li>各比率（n = 3）を独立した液滴の形成と各反復のために混合しながらのための実験を​​繰り返します。 </li></ol> 7.実証の原理MDA実験<ol><li>スペックでラムダDNAストック溶液の濃度を測定しますtrophotometer。 <ol><li> 1滴あたり平均10テンプレート分子に必要なテンプレートの濃度を計算します。このプロトコルでは、液滴体積は1 NLとラムダDNAを1 ngのは、約1.9×10 7コピーが含まれていると仮定します。そのため、1滴あたり10テンプレートはNLあたり10コピー、または1μl当たり526 FGラムダDNAとなります。テンプレートには、液滴が形成されている場合〜6倍、したがって、初期最高テンプレート濃度が3.2 PG /μLになる希釈化することになります。 </li></ol></li><li>逐次変性バッファーと同体積の中和バッファー3.2 PG /μlにラムダDNAを希釈します。 0.1の希釈率は、変性バッファーの45μlの10μlのサンプルを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。クエンチするために中和バッファーの45 LLを追加します。 </li><li>実験用サンプルの残りの部分を作るためにステップ7.2で説明したように、試料を希釈します。示す反応における初期鋳型濃度は、3.2 PG、320 FGました160 FG、32 FG、16 FG、3.2 FG、およびマイクロリットル当たり1.6 FG。 注意：マスターミックスの添加後の最終的なテンプレート濃度は526 FGた、52.6 FG、26.3 FG、5.26 FG、マイクロリットル当たり2.63 FG、526社、263社。 10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、およびそれぞれ1滴あたり0.005期待ラムダコピー。 </li><li>生成し、ステップ2.5から5.3に記載されているように、各サンプルからの液滴を分析します。 </li><li>デジタルカメラを使用して示す蛍光画像（ 図2,3）は、室温で10倍の対物レンズと落射蛍光顕微鏡に取り付けられ得ます。各サンプルのビューの12のフィールドを取得します。蛍光スライドを用いて得られた背景画像で補正蛍光画像。 </li><li>エマルジ ​​ョンオイルはすぐに蒸発するように、撮像37に含まれるチャンバーを使用してください。 </li><li> ImageJのマクロ（補足コードファイル）を使用して、個々の液滴の強度を分析します。 <ol><li>最高のNに非蛍光滴を分離する閾値蛍光強度を選択します高濃度のテンプレート画像内の蛍光液滴からTCの画像。各未知試料について、閾値より上の蛍光強度との液滴の割合を計算します。 </li></ol></li></ol> 8. PCRおよびMDAバルク反応<ol><li> PCR反応を準備します。 <ol><li>直列0.1の希釈率で鋳型DNAを希釈します。各希釈のために、変性緩衝液45μlのテンプレートを10μlを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの45μlの希釈を組み合わせます。 </li><li>サンプルあたりのPCRマスターミックス20μlのを準備します。 1.1倍PCR反応マスター混合物は、60単位/μlのTaq DNAポリメラーゼ、11mMのトリス-HCl、55ミリメートルのKCl、1.65ミリモルのMgCl 2、0.22 mMのdNTPを、1.1倍のdsDNA結合色素、1.1倍の参照色素、および550nmの成り各プライマー。 </li><li>希釈されたテンプレートを2μlとマスターミックス20μlのを兼ね備えています。 注意：最後の鋳型濃度トンで彼が示したPCR反応50頁、5頁、500 FG、マイクロリットル当たり50 FG、5 FG、500社、および0グラムラムダDNAたし、三連で行いました。 </li><li>以下のプログラムでのqPCR機における熱サイクルのPCR反応。 2分間72℃で2分間前に30秒、30秒、20秒57℃、72℃、95℃の40サイクルを実行し、4℃で保持します。 </li><li>二本鎖DNAは、更なる分析の前に参照色素蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。 </li></ol></li><li> MDA反応を準備します。 <ol><li>ステップ8.1.1で説明したようにサンプルを希釈します。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2倍MDA反応マスター混合物は、2倍のdsDNA結合色素、2倍のリファレンス色素、オリゴランダム化、50μM、2 mg / mlのBSA、2倍のファージphi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼフリー水、および40 / mlのから成りファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 </li><li>ポリメラーゼdを確保するために、最後の40μg/ mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼを追加OESは、7.5よりもはるかに高いまたは低いpHレベルは発生しませ。よく混ぜます。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの希釈したテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLを加えます。 </li><li>変性テンプレートの10μLとマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li><li>以下のプログラムで定量PCR機にMDA反応を実行します。 </li><li> 4時間30℃で保持し、蛍光ごとに7.5分を測定します。 </li><li> 1分間75℃で不活性化します。 </li><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、各サンプルの最大蛍光により正規化します。 </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

デジタルアッセイは、希少細胞の検出、および核酸分子の個々のカウントを可能にする強力な方法です。しかし、デジタルのアッセイは、まだ日常的に市販されている方法に関連する特殊な装置のコストを部分的には、分析ラボで適用によるものではありません。ここでは、標準的なリアルタイム定量PCR装置を用いて簡略化したアナログ読み出しと核酸を定量するためのエンドポイントのデ?...

核酸定量化（デジタルPCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。 過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。 WGA反応6の高収量は、単一分子7、単セル8および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル9からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連する主要な課題は、その汚染物質に対する極端な感度、個々のテンプレート分子6全体で不均一に増幅しています。 WGAによってWGA技術10の「キラーアプリケーション」、およびテンプレートの定量化は、アプリケーション7の多くの分野で重要であるように、単一のセルの順序が浮上しているようしかし、WGAが人気を集めています。 デジタル核酸定量化のための計測は、以前バルブ付きとバルブレスマイクロ流体フォーマのさまざまに記載されています小滴ベースのアッセイを含むTS 11-14、15,16（ 表2）。しかし、デジタル解析用の市販のマイクロ流体システムは、反応のセットアップと製品の検出に特化した17の機器を必要とします。カスタムバルブ付きマイクロフルイディクスは、柔軟であるが、高精度の微細加工と空気圧制御システム18が必要です 。それは、エマルジ ​​ョンベースのデジタルアッセイ19,20のために単分散の微小液滴を作ることは比較的簡単であるが、デジタル読み出しは、（人気の次世代配列決定技術に類似）のいずれかの大規模な広視野イメージング21,22を必要とする 、技術的に厄介であるか、または高速フローベースの滴検出23-25。理想的には、デジタル分析は、複雑な器具類の必要性を低減し、多数のサンプルを迅速に読み出すことができるように、読み出しにセットアップから簡単になります。ここでは、従来のリアルタイムPCR Iを使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を説明しますnstrumentは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定しました。 新しいアプローチは、デジタルPCRアッセイに適用することができるが、それは、（PCRのための優れた結果を与える）問題とリアルタイム増幅アッセイアナログれるデジタルWGAアッセイに特に有利です。 WGAは、一般的に、配列、長さ、及びベース含有量の不均一であるテンプレート分子にサンプルに適用されます。これらの異なる鋳型分子は、整合特性を有する参照（「標準」）のサンプルの使用を必要とする、異なる速度6で増幅されています。多くの場合、そのような標準が利用できない、または入ってくるサンプルの特性は不明です。入力された質量、分子の入力番号、2つ、またはいずれの組み合わせを-入力された材料の不均一性及びWGA化学の長さに依存する特性26はまた、定量化されているもので曖昧さを作成することによって、結果の解釈を複雑にします。 F任意の配列の汚染物質の分子が妨害する可能性があるためinally、配列非特異性は、定量的PCRよりも汚染に敏感定量的な複数置換増幅（MDA）をレンダリングします。マイクロ流体デジタルアッセイは、鋳型分子を分離し、より少ない汚染物質がサンプリングされるように、反応体積を減らすことによって、汚染に対処します。 ここでは、人気の等温WGA法、MDA 27を使用します 。注目すべきは、PicoPlexとMALBAC 28を含むいくつかの他のWGA化学は初期等温鎖置換手順に決定的に依存しています。等温ステップは、定量的WGAするアナログリアルタイムアッセイを適用する挑戦を悪化させます。 WGAは完全に不要な変数プレ増幅につながる、セットアップ中に防止なく、また離散化もできない（「循環」）異種の分子の複製が完了するまで駆動し、PCR前11のように、次のサイクルに停止することができる方法で、 </suP&gt;（ 図1）。 WGAのためのデジタルアッセイ形式は、（そのように前増幅は、結果には影響しません）アッセイエンドポイントでの列挙のための各分子の分離に起因する典型的な反応セットアップ手順をaccomodates元の読み出しが精度が増幅効率の変動に大きく依存することになることを意味します。 アッセイエンドポイントでの1滴あたりの信号レベルは液滴量に依存することになるようアッセイは、均一な体積で油中に生成される液滴に依存しており、我々は結果の一貫性は、液滴サイズの分布全体に平均化に依存する必要はありません。単分散液滴を作ることになりました（約​​3,500単分散液滴の論文は2013年以降に発行された）標準的な手順ですが、マイクロ流体計測器25を必要とします 。実際には、以上の6社は、このような液滴の生産に依存している独立した商用製品を開発している、と液滴作りのマイクロ流体チップは、23,29市販。この研究のために、私たちは内製のカスタムマイクロ流体デバイスを（プロトコルを参照）を使用しました。デバイスを通る流れを駆動するためのシリンジポンプはまた、市販されているが、代替的に、コストを削減する30真空駆動流のための単一の使い捨て注射器で置換することができます。

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。 私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。 我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。

従来のバルク/リアルタイム読み出し定量PCRおよび定量WGAアッセイ（ 図1）の両方に使用することができるが、デジタル定量的アッセイは、利点がある （表1）を提供します 。記載された方法では、単純なバルクエンドポイント測定（ 図2）を用いて、マイクロ液滴形式のデジタル分析を読み出します。この方法は広く適用可能であるが、この...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K ビュー.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

化学

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

遺伝学

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

生物工学

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

生物学

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

医学

<meta charset="utf8"></head><body>デジタルドロップレットPCRを用いたウイルスゲノム定量のための標準化されたプロトコール

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:正確なアデノ随伴ウイルスゲノム定量のためのデジタルドロップレットPCR法の最適化(英語)

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

要約

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定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

核酸の光度計微量定量

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量