私たちは、貴重な専門知識のための技術支援と博士Shivraj TyagiためEmeka Ifedigboに感謝。我々はまた、顕微鏡の支援のためにハーバードのNeuroDiscoveryセンターに感謝します。この作品は、イレールラム、およびAMK崔に贈られるNIHの助成金、R01 - HL60234、R01 - HL55330、R01 - HL079904に許可を09PRE2250120博士号を取得する前のアメリカ心臓協会によって部分的にサポートされていました。

全体的なプロトコルは、動物の組織、細胞増殖のための5-10日間、および気液界面での細胞分化のための追加10-14日からのセルのアイソレーションのための2日間が必要です。追加日は、セルのエクスポージャーとサンプルの収穫のために必要です。 1。マウス気管上皮細胞（MTEC）の単離。 注：すべての手順以下に説明するがレビューとブリガムアンドウィメンズ病院/ハーバードメディカルスクールのエリアでの動物実験使用の委員会によって承認されている。 始める前に： <ul><li>抗生物質を含むハムF12メディアを準備します。 250mLのハムのF12基礎培地（Cellgro）に100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューションと1000 X Fungizone液の250μLの2.50 mLを加える。 4週間まで4℃で保存する。 </li><li> 0.15％プロナーゼの溶液を調製します。抗生物質を含むハムF12メディアを10mLに15 mgのプロナーゼを追加。新鮮確認し、使用するまで氷上に置きます。 </li><li>清潔な作業面と滅菌手術器具小動物の手術のための適切な、およびセルのアイソレーションのためのラメラ組織培養フードを準備します。他のすべての機器は加湿CO 2インキュベーター、寒い部屋、卓上細胞遠心分離機、倒立顕微鏡、および使い捨てのプラスチックピペットと文化のウェアを含む動物細胞培養のための標準と考えられています。 </li><li>コラーゲンを準備I溶液（0.02 N酢酸で50μg/ mlの）。 12ウェルトランスウェルプレート（コーニング）の各ウェルにピペットを1.0 mLのコラーゲン溶液。パラフィルムでラップし、室温で平らな面に一晩放置する。 </li></ul><ol><li>市販のマウス系統（すなわち、男性の6-8週間のC57BL / 6、）を使用して、このようなCO 2誘導性昏睡のような安楽死の承認された方法を使用してマウスを安楽死させる。一般的に6匹のマウスは、種子を12穴トランスウェルプレートのに十分な細胞を（1.5〜2.0 × 10 5細胞/マウス）が得られます。 </li><li>フィールドを殺菌を70％EtOH溶液で動物の死体を吹き付けます。 </li><li>クリーン外科はさみやメスで、気管領域の周囲の皮膚を削除し、気管を公開。腹部を開くと、胸骨に沿って切断し、胸郭を削除します。気管の端が露出するまで組織を削除します。 </li><li>氷の上に、抗生物質を含有する30mLのハムのF12培地を含有する50mLのコニカルチューブに入れます気管。 </li><li>滅菌薄層流フードで、抗生物質を含有する10mLのハムのF12培地を含有する無菌の100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。 </li><li>優しく滅菌ピンセットと手術用はさみで結合組織を細かく分析。 </li><li>リンスに抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含有する新しい100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。内腔を露出させる縦軸に沿って気管をカット。 </li><li> 10 mLの0.15％プロナーゼ溶液を含む50 mLの試験管に気管を移し、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>二日目に、用意しておいてください。 <ul><li> DNase I溶液を準備します。に抗生物質を含むハムF12メディアの18 mLのは10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）ストック溶液2 mlを加え、粗膵臓DNase Iの10 mgのは、-20〜1mLのアリコートとストア° Cを（に融解してください使用前に氷）。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）と抗生物質を含むハムF12培地を準備。 〜200 mLのハムのF12基礎培地（Invitrogen社）を50mLの熱不活化FBS、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューション、および1000 X Fungizone液の250μLの2.5 mLを加え。 </li><li>抗生物質を含有MTEC基本培地を調製。に475.5 mLのDMEM/F12基本的なメディア（Cellgroは）7.5 mLの1 M HEPES溶液を、200mMのグルタミン溶液を、7.5％NaHCO 3溶液、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液5 mLを2 mLの10 mLの、500μLを加える1000 X Fungizoneソリューションの</li><li> MTEC medium/10％FBSを準備します。抗生物質を含有MTEC基本培地45 mLに、5mLの熱不活性化FBSを追加。 </li></ul></li><li>ゆっくりと（ステップ1.8から）10-12回チューブを揺すり、そしてそれが4で30〜60分放置℃を</li><li>チューブやロックの12倍に20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムF12メディアを追加します。 </li><li> 20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含む3 15 mLコニカルチューブを準備します。 </li><li>氷の上でこのソリューションを横に置く、プロナーゼ溶液から気管を外します。ハムのF12を含む最初のコニカルチューブに気管を移し、チューブを12回転倒混和します。このプロセスをさらに2回繰り返します。 </li><li> 1つの50 mlチューブにステップ1.13から三上清とプロナーゼ溶液を組み合わせる。残りの組織を捨てる。 </li><li>で10分間4℃で、そして上清を捨てる、1400rpm（- 4 - 62ローターを装備したエッペンドルフ5810Rの遠心分離機390 × g）で遠心。 </li><li>静かに1 mLのDNase溶液（100〜200μL/気管）でペレットを再懸濁そして氷上で5分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で5分間℃で1400rpm（390 × g）で遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 10％FBSを含む8 mLのMTEC培地中で細胞ペレットを再懸濁します</li><li> Primariaプレート（ファルコン）上にプレートの細胞懸濁液。 37℃95％空気の雰囲気の中でC、5時間（注：これは、線維芽細胞の負の選択のステップである）ため、5％CO 2。 </li><li>プレートから細胞懸濁液を収集し、4mLのMTECは、10％FBSを含むで二回プレートをすすぎます。プールの細胞懸濁液と50 mLコニカルチューブに一緒に洗う。 </li><li>サイトスピンおよび細胞計数用1 mLを節約する。 5,000 rpmで（エッペンドルフ5415D）で5分間卓上遠心機でスピン。残りの上清に、500μLのペレットを再懸濁しますを削除します。トリパンブルー生体染色法を用いて細胞計数のために100μLを使用してください。サイトスピン分析のために100μLの4アリコートを節約</li><li> 4℃、1400rpm（390 × g）で、残りの15 mLの細胞懸濁液をスピン℃で10分間。 </li></ol> 2。気液界面で伝播し、MTECの分化レチノイン酸のストック溶液を準備します。ストック溶液：95％エタノールに5 mMのストック溶液を作るために暗所でレチノイン酸（ミスター300.44グラム/モル）を秤量。 -80℃ホイル、ラップチューブで℃で保存必要に応じて、50μLの株式を、500μLBSA溶液（100 mg / mLの）と49.5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加することにより、ストック溶液Bを（5μM）を用意。箔の店舗は、4週間まで-80℃でチューブを包んだ。 レチノイン酸を含むMTEC増殖培地を準備します。抗生物質を含む45.7 mLのMTEC基礎培地に、2.5 mLの熱不活化FBS、1 mLのレチノイン酸証券B、250μLインスリン溶液（4mMの塩酸で2 mg / mLのインスリン）、250μL上皮成長因子の溶液（5μgの/を追加します。 1 mg / mLのBSAを含むHBSに溶解EGF）、200μLのウシ下垂体抽出物（HBSでの15 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）、50μLトランスフェリン溶液（HBSで5 mg / mLのトランスフェリン1 mg / mLのBSAを含む）、50μLコレラ毒素の溶液（HBSの100 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）。最終的なメディアの準備を滅菌濾過し、準備の2日以内に使用してください。 <ol><li>トランスウェルプレートからコラーゲン溶液を除去する、5分間ボンネットの下に放置し、PBSで2回洗浄する。 </li><li>以下の遠心分離は、ウェルあたり7.5 × 10 4 -1.0 × 10 5細胞のプレーティングを容易にするために増殖培地（500μL）の適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。トランスウェルのポリカーボネート膜インサートの先端表面にピペット500μLの細胞懸濁液。トランスウェルの底面コンパートメントに拡散媒体を1.5 ml加え。 </li><li> 37℃水中MTECの文化をインキュベートします7〜10日、95％空気、5％CO 2を含む加湿インキュベーターでCを。 </li><li>メディアを最初に変更する前に、三日待つ。一日おきにメディアを変更します。電極（EVOM Ohmvoltometer、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州）を用いて上皮細胞の抵抗の目視検査及び測定によって文化を監視します。 </li><li>細胞がコンフルエントに表示され、上皮抵抗が1000Ω/ cm 2のに達すると、細胞がALIで差別化する準備が整いました。 </li><li> 2％NuSerumを含むMTEC基礎培地を準備。 2％の最終濃度V / VにMTEC基本培地にNuSerum追加使用する前に、1 × 10 -7 Mの最終濃度にレチノイン酸ストックBを追加。新鮮な準備、2日以内に使用してください。 </li><li>細胞が頂メディアを削除すると2％Nuserumとレチノイン酸を含む750μLMTEC基礎培地と基本培地に置き換えることによって、10〜14日間を区別することができます。基礎培地を変更し、MTECは一日おきに2％NuSerumを含むで頂端側を洗う。 </li></ol> 3。培養上皮細胞へのタバコの煙のアプリケーション<ol><li> CSの細胞の露光装置（EMIインスツルメンツ、ピッツバーグ、PA）を使用して、たばこの主流煙にトランスウェル培養の先端側を公開します。装置の写真については、図1を参照してください。技術的な仕様については、特定の試薬と機器の表を参照してください。簡単に言うと、装置は、通気曝露チャンバーに接続されているポリプロピレンのラインに主流煙で描く、〜7月8日パフで各タバコを吸う蠕動ポンプで構成されています。暴露室は水を循環させることにより37℃でCを維持し、ガスラインで5％CO 2の雰囲気に維持されている。細胞は、ケンタッキー州3R4Fの研究の参照フィルタタバコを（たばこ総合研究所、ケンタッキー大学、レキシントン、ケンタッキー州）を使用して煙に曝露することができます。一般的に細胞は、全体の粒子状物質（TPM）100〜200ミリグラム/ m 3をもたらし、1-2タバコの煙にさらされています。対照培養物は、同等の露光期間に部屋の空気にさらされている。 </li><li> TPMは、TEに付属している製造業者のプロトコルに従って測定され- 10C喫煙のマシン（ティーグの企業）。簡単に言うと、フィルタは（Pallflex）定流量ポンプ（サンプリングユニット）に喫煙室でのサンプリングポートからリードするサンプリングチューブにインラインステンレス製ホルダーに配置されます。流出管は、ガスメータ（乾式ガスメータ、ONM61、67、AEM）にサンプリングユニットを接続します。フィルターは、ガスサンプリングの前後に秤量する。総物質はmgでフィルター上に堆積サンプリング空気の合計量に対して正規化されています。 </li><li>細胞は、任意の時点（すなわち、0〜24時間）スタンダードセル分析手順（すなわち、欧米のイムノブロット分析、mRNAの解析、等）または顕微鏡用露光後（すなわち、共焦点または電子顕微鏡）で収穫することができる。培養培地は、サイトカインや細胞毒性のアッセイのためのLDH放出を分析することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果 ALIで成功した上皮単離、増殖、及び分化は、石畳の形態で無傷の単分子層を生成する必要があります。健全な文化のTransepithelilalセル抵抗は、約1000から2000Ω/ cm 2とする必要があります。図2は、制御条件の下で、タバコの煙の曝露後の上皮細胞と繊毛のマーカーに染色したマウス呼吸器上皮細胞の単層を示しています。図3は、超微細構造と繊毛の形態を描いた、健康MTEC文化の代表的な電子顕微鏡写真を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="図1" /> 図1三相、単離工程、繁殖の段階、および気液界面（スキーム）で、差別化の段階を通じて、上皮細胞の進行の準備。上皮細胞は、マウス気管から分離彼らは液体培養で増殖transwellsに播種し、彼らは完全に区別する気液界面に変換されます。実験は、通常、連続培養24日目に実施しています。写真は、たばこの主流煙に培養細胞の曝露のためのモデルシステムを示しています。トランスウェルALI培養系は、温度、湿度、CO 2のために制御されているカスタムモジュール式のタバコの煙のデリバリーシステム内に配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="図2" /> 。と繊毛のマーカーアセチル化α-チューブリン（赤、Cy3結合二次抗体）、 図2上皮細胞培養は、F -アクチン（アレクサ- ® 488標識ファロイジン緑）、核（ヘキスト33258）のために固定し、染色した。下のパネルは4時間、タバコの煙への曝露（2本のタバコ、150 mgの/ m 3）の後に採取した上皮細胞と同等の画像を示す。示されているように（B）乳酸脱水素酵素（LDH）放出は、24時間タバコの煙の様々な用量に暴露した後の基礎培地で測定した。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="図3" /> 図3マウス気管上皮から分離された上皮細胞の気液界面培養は、透過型電子顕微鏡によって（TEM）繊毛、基底、および非繊毛細胞1の特性を持っているいくつかのサブタイプに分化する。これらの細胞は多列気道上皮を象徴化する。図のラベルはに対応しています：BB：基礎体温、：軸糸、M：ミトコンドリア、N：核、S：基板（ポリカーボネート膜）、MV：microvili

<ol>
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利害の衝突は宣言されません。

マウス気管上皮細胞の単離を記述するプロトコルは、1、。あなたらのプロトコルから適応、およびその他の変更で2-3。れるセルのアイソレーションを記述する任意のプロトコルと同様に、最も重要な側面は、厳格な無菌操作を用いて、細菌または真菌病原体からの汚染を避けるためです。 2番目に重要なステップは、ステップ1.19で説明されているように線維芽?...

*喫煙のマシンは14&quot;X14&quot;X20&quot;デュアルチャンバーと水ジャケット光の色合い明確な証拠1 / 2&quot;システムをシャットオフ制御する温度制御、水位センサーとタバコの煙の曝露のための厚いポリカーボネートレキサンチャンバー設計、製造されたカスタムです。ユニットを吸う/たばこを吸​​うタバコは、レートをパフ変数タバコのためにインストールされています。ユニットが使用されている場合、それは温度、湿度、二酸化炭素がシステムに制御されるという意味でインキュベーターを模倣しています。システムには含まれています：（I）組織培養実験のための制御された環境を維持するカスタマイズされたデュアルチャンバー/水ジャケットユニットを。 （II）水位センサーと温度制御付きデジタルヘビーデューティー、高精度デュアルポンプの水の温度循環システムポンプをパフ付き（III）喫煙ユニット。 （IV）ポンプサイクルセンサー制御率サイクラー（IV）フィルターホルダーラインのステンレス鋼高精度。 （V）取り外し可能なふたはのための括弧で11 / 2&quot;サイズ軸方向均一性のタバコの煙の混合ファン。（VI）水循​​環装置用取付金具付きミディアムサイズの水浴。（VII）1 / 2&quot;厚のプレキシグラスのトレイにマウントたばこの灰のコレクターのためのポンプとホルダーをふかす。 説明したようにこのマシンは、東証のシステム（から利用できる一種とし ​​て同じような市販の喫煙のマシンに置換することができる<a href="http://www.tse-systems.com">www.tse - systems.com</a> ）。

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面（ALI）で培養することができます。プロトコルは、CSの曝露に上皮細胞の応答を研究するために、たばこの主流煙（CS）にこれらの細胞を分離し、公開するために記述されています。マウス気管、気液界面（ALI）として完全に分化した上皮細胞におけるこれらの細胞の培養、及び培養中のこれらの細胞に校正された主流CSの配信から気道上皮細胞の分離：プロトコルは、次の3つの部分から構成されています。 ALI培養系は、より密接に通常の液体培養系よりも生理の設定に似ている条件の下で呼吸上皮の文化を可能にします。 CSの暴露分子と肺細胞応答の研究は、人間の健康に対する環境大気汚染の影響を理解することの重要なコンポーネントです。この分野での研究成果は、最終的に慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および世界の主要な健康上の問題を表す他のタバコ関連疾患の病因の理解に向けて貢献するかもしれない。

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

33.8K ビュー.  Harvard Medical School. 肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

医学

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

電子たばこの蒸気とたばこの煙が小説に与える影響の比較<em&gt;インビボ</em&gt;露光システム

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.