私たちは、貴重な専門知識のための技術支援と博士Shivraj TyagiためEmeka Ifedigboに感謝。我々はまた、顕微鏡の支援のためにハーバードのNeuroDiscoveryセンターに感謝します。この作品は、イレールラム、およびAMK崔に贈られるNIHの助成金、R01 - HL60234、R01 - HL55330、R01 - HL079904に許可を09PRE2250120博士号を取得する前のアメリカ心臓協会によって部分的にサポートされていました。

全体的なプロトコルは、動物の組織、細胞増殖のための5-10日間、および気液界面での細胞分化のための追加10-14日からのセルのアイソレーションのための2日間が必要です。追加日は、セルのエクスポージャーとサンプルの収穫のために必要です。 1。マウス気管上皮細胞（MTEC）の単離。 注：すべての手順以下に説明するがレビューとブリガムアンドウィメンズ病院/ハーバードメディカルスクールのエリアでの動物実験使用の委員会によって承認されている。 始める前に： <ul><li>抗生物質を含むハムF12メディアを準備します。 250mLのハムのF12基礎培地（Cellgro）に100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューションと1000 X Fungizone液の250μLの2.50 mLを加える。 4週間まで4℃で保存する。 </li><li> 0.15％プロナーゼの溶液を調製します。抗生物質を含むハムF12メディアを10mLに15 mgのプロナーゼを追加。新鮮確認し、使用するまで氷上に置きます。 </li><li>清潔な作業面と滅菌手術器具小動物の手術のための適切な、およびセルのアイソレーションのためのラメラ組織培養フードを準備します。他のすべての機器は加湿CO 2インキュベーター、寒い部屋、卓上細胞遠心分離機、倒立顕微鏡、および使い捨てのプラスチックピペットと文化のウェアを含む動物細胞培養のための標準と考えられています。 </li><li>コラーゲンを準備I溶液（0.02 N酢酸で50μg/ mlの）。 12ウェルトランスウェルプレート（コーニング）の各ウェルにピペットを1.0 mLのコラーゲン溶液。パラフィルムでラップし、室温で平らな面に一晩放置する。 </li></ul><ol><li>市販のマウス系統（すなわち、男性の6-8週間のC57BL / 6、）を使用して、このようなCO 2誘導性昏睡のような安楽死の承認された方法を使用してマウスを安楽死させる。一般的に6匹のマウスは、種子を12穴トランスウェルプレートのに十分な細胞を（1.5〜2.0 × 10 5細胞/マウス）が得られます。 </li><li>フィールドを殺菌を70％EtOH溶液で動物の死体を吹き付けます。 </li><li>クリーン外科はさみやメスで、気管領域の周囲の皮膚を削除し、気管を公開。腹部を開くと、胸骨に沿って切断し、胸郭を削除します。気管の端が露出するまで組織を削除します。 </li><li>氷の上に、抗生物質を含有する30mLのハムのF12培地を含有する50mLのコニカルチューブに入れます気管。 </li><li>滅菌薄層流フードで、抗生物質を含有する10mLのハムのF12培地を含有する無菌の100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。 </li><li>優しく滅菌ピンセットと手術用はさみで結合組織を細かく分析。 </li><li>リンスに抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含有する新しい100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。内腔を露出させる縦軸に沿って気管をカット。 </li><li> 10 mLの0.15％プロナーゼ溶液を含む50 mLの試験管に気管を移し、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>二日目に、用意しておいてください。 <ul><li> DNase I溶液を準備します。に抗生物質を含むハムF12メディアの18 mLのは10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）ストック溶液2 mlを加え、粗膵臓DNase Iの10 mgのは、-20〜1mLのアリコートとストア° Cを（に融解してください使用前に氷）。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）と抗生物質を含むハムF12培地を準備。 〜200 mLのハムのF12基礎培地（Invitrogen社）を50mLの熱不活化FBS、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューション、および1000 X Fungizone液の250μLの2.5 mLを加え。 </li><li>抗生物質を含有MTEC基本培地を調製。に475.5 mLのDMEM/F12基本的なメディア（Cellgroは）7.5 mLの1 M HEPES溶液を、200mMのグルタミン溶液を、7.5％NaHCO 3溶液、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液5 mLを2 mLの10 mLの、500μLを加える1000 X Fungizoneソリューションの</li><li> MTEC medium/10％FBSを準備します。抗生物質を含有MTEC基本培地45 mLに、5mLの熱不活性化FBSを追加。 </li></ul></li><li>ゆっくりと（ステップ1.8から）10-12回チューブを揺すり、そしてそれが4で30〜60分放置℃を</li><li>チューブやロックの12倍に20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムF12メディアを追加します。 </li><li> 20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含む3 15 mLコニカルチューブを準備します。 </li><li>氷の上でこのソリューションを横に置く、プロナーゼ溶液から気管を外します。ハムのF12を含む最初のコニカルチューブに気管を移し、チューブを12回転倒混和します。このプロセスをさらに2回繰り返します。 </li><li> 1つの50 mlチューブにステップ1.13から三上清とプロナーゼ溶液を組み合わせる。残りの組織を捨てる。 </li><li>で10分間4℃で、そして上清を捨てる、1400rpm（- 4 - 62ローターを装備したエッペンドルフ5810Rの遠心分離機390 × g）で遠心。 </li><li>静かに1 mLのDNase溶液（100〜200μL/気管）でペレットを再懸濁そして氷上で5分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で5分間℃で1400rpm（390 × g）で遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 10％FBSを含む8 mLのMTEC培地中で細胞ペレットを再懸濁します</li><li> Primariaプレート（ファルコン）上にプレートの細胞懸濁液。 37℃95％空気の雰囲気の中でC、5時間（注：これは、線維芽細胞の負の選択のステップである）ため、5％CO 2。 </li><li>プレートから細胞懸濁液を収集し、4mLのMTECは、10％FBSを含むで二回プレートをすすぎます。プールの細胞懸濁液と50 mLコニカルチューブに一緒に洗う。 </li><li>サイトスピンおよび細胞計数用1 mLを節約する。 5,000 rpmで（エッペンドルフ5415D）で5分間卓上遠心機でスピン。残りの上清に、500μLのペレットを再懸濁しますを削除します。トリパンブルー生体染色法を用いて細胞計数のために100μLを使用してください。サイトスピン分析のために100μLの4アリコートを節約</li><li> 4℃、1400rpm（390 × g）で、残りの15 mLの細胞懸濁液をスピン℃で10分間。 </li></ol> 2。気液界面で伝播し、MTECの分化レチノイン酸のストック溶液を準備します。ストック溶液：95％エタノールに5 mMのストック溶液を作るために暗所でレチノイン酸（ミスター300.44グラム/モル）を秤量。 -80℃ホイル、ラップチューブで℃で保存必要に応じて、50μLの株式を、500μLBSA溶液（100 mg / mLの）と49.5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加することにより、ストック溶液Bを（5μM）を用意。箔の店舗は、4週間まで-80℃でチューブを包んだ。 レチノイン酸を含むMTEC増殖培地を準備します。抗生物質を含む45.7 mLのMTEC基礎培地に、2.5 mLの熱不活化FBS、1 mLのレチノイン酸証券B、250μLインスリン溶液（4mMの塩酸で2 mg / mLのインスリン）、250μL上皮成長因子の溶液（5μgの/を追加します。 1 mg / mLのBSAを含むHBSに溶解EGF）、200μLのウシ下垂体抽出物（HBSでの15 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）、50μLトランスフェリン溶液（HBSで5 mg / mLのトランスフェリン1 mg / mLのBSAを含む）、50μLコレラ毒素の溶液（HBSの100 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）。最終的なメディアの準備を滅菌濾過し、準備の2日以内に使用してください。 <ol><li>トランスウェルプレートからコラーゲン溶液を除去する、5分間ボンネットの下に放置し、PBSで2回洗浄する。 </li><li>以下の遠心分離は、ウェルあたり7.5 × 10 4 -1.0 × 10 5細胞のプレーティングを容易にするために増殖培地（500μL）の適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。トランスウェルのポリカーボネート膜インサートの先端表面にピペット500μLの細胞懸濁液。トランスウェルの底面コンパートメントに拡散媒体を1.5 ml加え。 </li><li> 37℃水中MTECの文化をインキュベートします7〜10日、95％空気、5％CO 2を含む加湿インキュベーターでCを。 </li><li>メディアを最初に変更する前に、三日待つ。一日おきにメディアを変更します。電極（EVOM Ohmvoltometer、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州）を用いて上皮細胞の抵抗の目視検査及び測定によって文化を監視します。 </li><li>細胞がコンフルエントに表示され、上皮抵抗が1000Ω/ cm 2のに達すると、細胞がALIで差別化する準備が整いました。 </li><li> 2％NuSerumを含むMTEC基礎培地を準備。 2％の最終濃度V / VにMTEC基本培地にNuSerum追加使用する前に、1 × 10 -7 Mの最終濃度にレチノイン酸ストックBを追加。新鮮な準備、2日以内に使用してください。 </li><li>細胞が頂メディアを削除すると2％Nuserumとレチノイン酸を含む750μLMTEC基礎培地と基本培地に置き換えることによって、10〜14日間を区別することができます。基礎培地を変更し、MTECは一日おきに2％NuSerumを含むで頂端側を洗う。 </li></ol> 3。培養上皮細胞へのタバコの煙のアプリケーション<ol><li> CSの細胞の露光装置（EMIインスツルメンツ、ピッツバーグ、PA）を使用して、たばこの主流煙にトランスウェル培養の先端側を公開します。装置の写真については、図1を参照してください。技術的な仕様については、特定の試薬と機器の表を参照してください。簡単に言うと、装置は、通気曝露チャンバーに接続されているポリプロピレンのラインに主流煙で描く、〜7月8日パフで各タバコを吸う蠕動ポンプで構成されています。暴露室は水を循環させることにより37℃でCを維持し、ガスラインで5％CO 2の雰囲気に維持されている。細胞は、ケンタッキー州3R4Fの研究の参照フィルタタバコを（たばこ総合研究所、ケンタッキー大学、レキシントン、ケンタッキー州）を使用して煙に曝露することができます。一般的に細胞は、全体の粒子状物質（TPM）100〜200ミリグラム/ m 3をもたらし、1-2タバコの煙にさらされています。対照培養物は、同等の露光期間に部屋の空気にさらされている。 </li><li> TPMは、TEに付属している製造業者のプロトコルに従って測定され- 10C喫煙のマシン（ティーグの企業）。簡単に言うと、フィルタは（Pallflex）定流量ポンプ（サンプリングユニット）に喫煙室でのサンプリングポートからリードするサンプリングチューブにインラインステンレス製ホルダーに配置されます。流出管は、ガスメータ（乾式ガスメータ、ONM61、67、AEM）にサンプリングユニットを接続します。フィルターは、ガスサンプリングの前後に秤量する。総物質はmgでフィルター上に堆積サンプリング空気の合計量に対して正規化されています。 </li><li>細胞は、任意の時点（すなわち、0〜24時間）スタンダードセル分析手順（すなわち、欧米のイムノブロット分析、mRNAの解析、等）または顕微鏡用露光後（すなわち、共焦点または電子顕微鏡）で収穫することができる。培養培地は、サイトカインや細胞毒性のアッセイのためのLDH放出を分析することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果 ALIで成功した上皮単離、増殖、及び分化は、石畳の形態で無傷の単分子層を生成する必要があります。健全な文化のTransepithelilalセル抵抗は、約1000から2000Ω/ cm 2とする必要があります。図2は、制御条件の下で、タバコの煙の曝露後の上皮細胞と繊毛のマーカーに染色したマウス呼吸器上皮細胞の単層を示しています。図3は、超微細構造と繊毛の形態を描いた、健康MTEC文化の代表的な電子顕微鏡写真を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="図1" /> 図1三相、単離工程、繁殖の段階、および気液界面（スキーム）で、差別化の段階を通じて、上皮細胞の進行の準備。上皮細胞は、マウス気管から分離彼らは液体培養で増殖transwellsに播種し、彼らは完全に区別する気液界面に変換されます。実験は、通常、連続培養24日目に実施しています。写真は、たばこの主流煙に培養細胞の曝露のためのモデルシステムを示しています。トランスウェルALI培養系は、温度、湿度、CO 2のために制御されているカスタムモジュール式のタバコの煙のデリバリーシステム内に配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="図2" /> 。と繊毛のマーカーアセチル化α-チューブリン（赤、Cy3結合二次抗体）、 図2上皮細胞培養は、F -アクチン（アレクサ- ® 488標識ファロイジン緑）、核（ヘキスト33258）のために固定し、染色した。下のパネルは4時間、タバコの煙への曝露（2本のタバコ、150 mgの/ m 3）の後に採取した上皮細胞と同等の画像を示す。示されているように（B）乳酸脱水素酵素（LDH）放出は、24時間タバコの煙の様々な用量に暴露した後の基礎培地で測定した。 <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="図3" /> 図3マウス気管上皮から分離された上皮細胞の気液界面培養は、透過型電子顕微鏡によって（TEM）繊毛、基底、および非繊毛細胞1の特性を持っているいくつかのサブタイプに分化する。これらの細胞は多列気道上皮を象徴化する。図のラベルはに対応しています：BB：基礎体温、：軸糸、M：ミトコンドリア、N：核、S：基板（ポリカーボネート膜）、MV：microvili

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利害の衝突は宣言されません。

マウス気管上皮細胞の単離を記述するプロトコルは、1、。あなたらのプロトコルから適応、およびその他の変更で2-3。れるセルのアイソレーションを記述する任意のプロトコルと同様に、最も重要な側面は、厳格な無菌操作を用いて、細菌または真菌病原体からの汚染を避けるためです。 2番目に重要なステップは、ステップ1.19で説明されているように線維芽?...

*喫煙のマシンは14&quot;X14&quot;X20&quot;デュアルチャンバーと水ジャケット光の色合い明確な証拠1 / 2&quot;システムをシャットオフ制御する温度制御、水位センサーとタバコの煙の曝露のための厚いポリカーボネートレキサンチャンバー設計、製造されたカスタムです。ユニットを吸う/たばこを吸​​うタバコは、レートをパフ変数タバコのためにインストールされています。ユニットが使用されている場合、それは温度、湿度、二酸化炭素がシステムに制御されるという意味でインキュベーターを模倣しています。システムには含まれています：（I）組織培養実験のための制御された環境を維持するカスタマイズされたデュアルチャンバー/水ジャケットユニットを。 （II）水位センサーと温度制御付きデジタルヘビーデューティー、高精度デュアルポンプの水の温度循環システムポンプをパフ付き（III）喫煙ユニット。 （IV）ポンプサイクルセンサー制御率サイクラー（IV）フィルターホルダーラインのステンレス鋼高精度。 （V）取り外し可能なふたはのための括弧で11 / 2&quot;サイズ軸方向均一性のタバコの煙の混合ファン。（VI）水循​​環装置用取付金具付きミディアムサイズの水浴。（VII）1 / 2&quot;厚のプレキシグラスのトレイにマウントたばこの灰のコレクターのためのポンプとホルダーをふかす。 説明したようにこのマシンは、東証のシステム（から利用できる一種とし ​​て同じような市販の喫煙のマシンに置換することができる<a href="http://www.tse-systems.com">www.tse - systems.com</a> ）。

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面（ALI）で培養することができます。プロトコルは、CSの曝露に上皮細胞の応答を研究するために、たばこの主流煙（CS）にこれらの細胞を分離し、公開するために記述されています。マウス気管、気液界面（ALI）として完全に分化した上皮細胞におけるこれらの細胞の培養、及び培養中のこれらの細胞に校正された主流CSの配信から気道上皮細胞の分離：プロトコルは、次の3つの部分から構成されています。 ALI培養系は、より密接に通常の液体培養系よりも生理の設定に似ている条件の下で呼吸上皮の文化を可能にします。 CSの暴露分子と肺細胞応答の研究は、人間の健康に対する環境大気汚染の影響を理解することの重要なコンポーネントです。この分野での研究成果は、最終的に慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および世界の主要な健康上の問題を表す他のタバコ関連疾患の病因の理解に向けて貢献するかもしれない。

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

33.9K ビュー.  Harvard Medical School. 肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。

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Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

免疫・感染学

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

生物工学

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

医学

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes susceptibility to bacterial infections in the respiratory system. However, the effects of cigarette smoking on bacterial infections in human lung epithelial cells have yet to be thoroughly studied. Described here is a detailed protocol for the preparation of cigarette smoking extracts (CSE), treatment of human lung epithelial cells with CSE, and bacterial infection and infection determination. CSE was prepared with a conventional method. Lung epithelial cells were treated with 4% CSE for 3 h. CSE-treated cells were, then, infected with Pseudomonas at a multiplicity of infection (MOI) of 10. Bacterial loads of the cells were determined by three different methods. The results showed that CSE increased Pseudomonas load in lung epithelial cells. This protocol, therefore, provides a simple and reproducible approach to study the effect of cigarette smoke on bacterial infections in lung epithelial cells.

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Described here is a protocol to study how cigarette smoke extract affects bacterial colonization in lung epithelial cells.

肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

全身吸入システムを用いたマウスのタバコの煙暴露

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

初代マウス肺内皮細胞の単離

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled substances, including infectious agents and air pollutants. The airway epithelial layer plays a central role in a large variety of acute and chronic lung diseases, and various treatments targeting this epithelium are administered by inhalation. Understanding the role of epithelium in pathogenesis and how it can be targeted for therapy requires robust and representative models. In vitro epithelial culture models are increasingly being used and offer the advantage of performing experiments in a controlled environment, exposing the cells to different kinds of stimuli, toxicants, or infectious agents. The use of primary cells instead of immortalized or tumor cell lines has the advantage that these cells differentiate in culture to a pseudostratified polarized epithelial cell layer with a better representation of the epithelium compared to cell lines.
Presented here is a robust protocol, that has been optimized over the past decades, for the isolation and culture of airway epithelial cells from lung tissue. This procedure allows successful isolation, expansion, culture, and mucociliary differentiation of primary bronchial epithelial cells (PBECs) by culturing at the air-liquid interface (ALI) and includes a protocol for biobanking. Furthermore, the characterization of these cultures using cell-specific marker genes is described. These ALI-PBEC cultures can be used for a range of applications, including exposure to whole cigarette smoke or inflammatory mediators, and co-culture/infection with viruses or bacteria. 
The protocol provided in this manuscript, illustrating the procedure in a step-by-step manner, is expected to provide a basis and/or reference for those interested in implementing or adapting such culture systems in their laboratory.

Presented here is a reproducible, affordable, and robust method for the isolation and expansion of primary bronchial epithelial cells for long-term biobanking and the generation of differentiated epithelial cells by culture at the air-liquid interface.

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

<meta charset="utf8"></head><body>フローサイトメトリーのためのマウス肺からの免疫細胞および非免疫細胞の単離(英語)

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

要約

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マウス肺樹状細胞の分離

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

肺上皮細胞におけるシュードモナス感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

全身吸入システムを用いたマウスのタバコの煙暴露

初代マウス肺内皮細胞の単離

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

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マウス肺樹状細胞の分離

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

全身吸入システムを用いたマウスのタバコの煙暴露

初代マウス肺内皮細胞の単離

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

肺上皮細胞におけるシュードモナス感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究