Damos las gracias a Emeka Ifedigbo de asistencia técnica y el Dr. Shivraj Tyagi por su valiosa experiencia. También agradecemos al Centro de NeuroDiscovery Harvard para obtener ayuda con la microscopía. Este trabajo fue apoyado en parte por una asociación americana del corazón predoctorales para conceder 09PRE2250120 Hilaire Lam, y las subvenciones del NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, adjudicado a AMK Choi.

El protocolo general requiere de dos días para aislamientos de células de tejido animal, de 5-10 días para la proliferación celular, y un adicional de 10 a 14 días para la diferenciación celular en la interfaz aire-líquido. Un día adicional se requiere para las exposiciones de la célula y la recolección de muestras. 1. Aislamiento de ratón traqueobronquial las células epiteliales (MTEC). Nota: Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados ​​y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Brigham y el Hospital de la Mujer / Area de Harvard Medical School. Antes de empezar: <ul><li> Prepare F12 Ham medios que contienen antibióticos. F12 medio basal de 250 ml de Ham (Cellgro) añadir 2,50 ml de una penicilina 100 X / estreptomicina (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) y 250 l de una solución de 1000 X Fungizone. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas. </li><li> Prepare una solución de 0,15% Pronasa. Añadir 15 mg Pronasa a 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos. Hacer libre y mantenerla en hielo hasta su uso. </li><li> Prepare una superficie de trabajo limpia y estéril de instrumentos quirúrgicos apropiados para cirugía de pequeños animales, y una capucha de cultivo de tejido laminar para aislamientos de células. El resto del equipo se considera estándar para el cultivo de células animales incluyendo humidificado incubadoras de CO 2, cuarto frío, células de mesa centrífugas, microscopio invertido, y una pipeta de plástico desechables y utensilios de la cultura. </li><li> Prepare una solución de colágeno I (50 mg / mL en 0,02 N de ácido acético). Pipetear 1,0 ml de solución de colágeno en cada pocillo de una placa de 12 y Transwell (Corning). Envuelva en parafina y se deja reposar durante la noche sobre una superficie plana a temperatura ambiente. </li></ul><ol><li> Utilizando una cepa de ratón comercialmente disponible (es decir, C57BL / 6, masculino 6-8 semanas de edad), la eutanasia a los ratones usando un método aprobado de la eutanasia como el CO 2 inducida por la narcosis. Generalmente de 6 ratones rendimiento suficiente de células (1,5-2,0 x 10 5 células / ratón) a las semillas de una placa de 12 pocillos Transwell. </li><li> Rocíe los cadáveres de animales con el 70% de solución de EtOH para esterilizar el campo. </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas limpias y el bisturí, quitar la piel alrededor del área de la tráquea, y exponer la tráquea. Abrir el abdomen, corte a lo largo del esternón, y quitar la caja torácica. Eliminar el tejido hasta el final de la tráquea está expuesto. </li><li> Tráqueas lugar en un tubo cónico de 50 ml que contienen 30 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos, sobre el hielo. </li><li> En una campana de flujo laminar estéril, la transferencia de tejido traqueal a un estéril 100 mm placa de Petri que contiene 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos. </li><li> Suavemente diseccionar tejido conectivo con una pinza estéril y tijeras quirúrgicas. </li><li> La transferencia de tejido traqueal a un nuevo plato de 100 mm de Petri con 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos para enjuagar. Cortar tráqueas largo del eje vertical para exponer luz. </li><li> Transferencia de tráqueas a un tubo de 50 ml que contienen 10 ml 0,15% de solución Pronasa e incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> En el segundo día, se han preparado: <ul><li> Prepare una solución de DNAsa I. A 18 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos agregar 2 ml de 10 mg / ml de suero bovino solución de albúmina de acciones (BSA), y 10 mg de crudo de páncreas DNAsa I. Hacer alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ° C (descongelados a hielo antes de su uso). </li><li> Prepare F12 Ham medios que contienen antibióticos con un 20% de suero fetal bovino (FBS). F12 medio basal de 200 ml de Ham (Invitrogen), agregar 50 ml de FBS inactivado por calor, 2,5 ml de penicilina 100 X / estreptomicina (10 2 U/mL-10 2 mg / ml), y 250 l de una solución de 1000 X Fungizone . </li><li> Preparar el medio MTEC básica que contenga antibióticos. A 475,5 ml DMEM/F12 los medios básicos (Cellgro) añadir 7,5 ml de solución de HEPES 1 M, 10 ml de solución de 200 mM de glutamina, 2 ml de un 7,5% solución de NaHCO3, 5 ml de penicilina 100 X / solución de estreptomicina, 500 l de una solución X 1000 Fungizone </li><li> Prepare MTEC% de SFB medium/10. A 45 mL de medio MTEC básico que contiene antibióticos, añadir 5 ml de FBS inactivado por calor. </li></ul></li><li> Agite suavemente el tubo (del Paso 1.8) 10.12 veces, y luego se deja reposar durante 30-60 minutos a 4 ° C. </li><li> Agregar 10 ml de Ham F12 medios de comunicación que contiene 20% de SFB y antibióticos para el tubo y la roca en 12 ocasiones. </li><li> Prepare tres tubos de 15 ml cónicos que contienen 10 ml de Ham F12 medios de comunicación que contiene 20% de SFB y antibióticos. </li><li> Quite las tráqueas de la solución Pronasa, dejando de lado esta solución en el hielo. Transferencia de tráqueas de primer tubo cónico que contiene F12 Ham e invierta el tubo 12 veces. Repita este proceso dos veces más. </li><li> Combine solución Pronasa con los tres sobrenadantes de paso 1,13 en un tubo de 50 ml. Deshágase de los pañuelos restantes. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm (390 xg, Eppendorf 5810R centrífuga equipada con un rotor A-4-62) durante 10 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante. </li><li> Suavemente resuspender el precipitado en 1 ml de solución de DNAsa (100-200 l / tráquea)e incubar 5 min en hielo. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm (390 xg) durante 5 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el botón celular en 8 ml de medio MTEC contiene 10% de SFB </li><li> Placa de suspensión celular en placas de Primaria (Falcon). Se incuba a 37 ° C en una atmósfera de aire del 95%, 5% de CO 2 durante 5 horas (Nota: esta es una etapa de selección negativa de los fibroblastos). </li><li> Recoger la suspensión de células de las placas y aclare las placas dos veces con 4 ml MTEC contiene 10% de SFB. Suspensión de reserva de las células y se lava en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> La conservación de 1 ml por citocentrifugación y el recuento de células. Girar en una centrífuga de mesa durante 5 min a 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Eliminar 500 l y el pellet se resuspende en el sobrenadante restante. Use 100 L para el recuento de células utilizando el método de azul de tripano tinción vital. La conservación de 4 alícuotas de 100 l para el análisis citospina </li><li> Girar otros 15 ml de suspensión celular a 1400 rpm (390 xg), a 4 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. La propagación y la diferenciación de MTEC En la interfaz aire-líquido Preparar soluciones estándar de ácido retinoico. Una solución de archivo: Pesar ácido retinoico en la oscuridad (Sr. 300,44 g / mol) para hacer una solución 5 mM de valores en EtOH al 95%. Almacenar en un tubo de papel de aluminio envuelto a -80 ° C. Según sea necesario, preparar una solución de archivo B (5 mM) mediante la adición de 50 l de archivo A, 500 l solución de BSA (100 mg / ml) y 49,5 ml de Hank solución salina balanceada (HBSS). Almacenar en un tubo de papel de aluminio envuelto a -80 ° C durante un máximo de 4 semanas. Preparar el medio de la proliferación MTEC que contienen ácido retinoico. A 45,7 mL medios MTEC basal contiene antibióticos, añadir 2,5 ml SFB inactivado por calor, 1 mL ácido retinoico archivo B, 250 l solución de insulina (2 mg / ml de insulina en 4 mM HCl), 250 l solución de factor de crecimiento epidérmico (5 mg / mL FEAG en HBS con 1 mg / ml de BSA), 200 l extracto de pituitaria bovina (15 mg / ml en HBS con 1 mg / ml de BSA), 50 l solución de transferrina (5 mg / ml de transferrina en HBS con 1 mg / ml de BSA ), 50 l solución de la toxina del cólera (100 mg / mL en HBS con 1 mg / ml de BSA). Filtro de esterilización de la preparación de medios y el uso final de un plazo de 2 días de preparación. <ol><li> Retire la solución de colágeno a partir de placas Transwell, deje reposar bajo el capó durante 5 minutos y lavar con PBS 2 veces. </li><li> Después de la centrifugación, resuspender el botón celular en un volumen adecuado de la proliferación de los medios de comunicación (500 l) para facilitar la chapa de 7,5 x 10 4 -1,0 x10 5 células por pocillo. Pipetear 500 l de suspensión celular sobre la superficie apical de la inserción de la membrana de policarbonato Transwell. Añadir 1,5 ml de los medios de comunicación la proliferación en el compartimento basal de la Transwell. </li><li> Incubar las culturas MTEC sumergido a 37 º C en un incubador humidificado contiene 95% de aire, 5% de CO 2 durante 7-10 días. </li><li> Esperar tres días antes de cambiar los medios de comunicación por primera vez. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Monitor de culturas mediante la inspección visual y la medición de resistencia de las células transepitelial utilizando un electrodo (EVOM Ohmvoltometer, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL). </li><li> Cuando las células parecen confluir y resistencia epitelial llega a 1000 Ω / cm 2, las células están preparados para diferenciar a ALI. </li><li> Prepare MTEC medio basal que contiene 2% NuSerum. Añadir NuSerum a medio MTEC básicos para una concentración final de 2% V / V. Añadir B retinoico archivo ácido a una concentración final de 1 x 10 -7 M antes de usar. Prepare frescos y el uso dentro de 2 días. </li><li> Permiten diferenciar células durante 10-14 días, mediante la eliminación de los medios de comunicación apical y reemplazar el medio basal con 750 l de medios MTEC basal que contiene 2% de ácido retinoico y Nuserum. Cambiar el medio basal y lavar la parte apical con MTEC que contiene 2% NuSerum cada dos días. </li></ol> 3. Aplicación de humo del cigarrillo a cultivos de células epiteliales <ol><li> Exponer la parte apical de las culturas Transwell al humo del cigarrillo convencional usando una celda de CS sistema de exposición (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Ver Figura 1 para la fotografía de los aparatos. Ver Tabla de reactivos y equipos específicos para las especificaciones técnicas. En resumen, el aparato consiste en una bomba peristáltica que fuma cada cigarrillo en ~ 7-8 inhalaciones, basándose en la corriente principal de humo en una línea de polipropileno que se conecta a una cámara de exposición ventilados. La cámara de exposición se mantiene a 37 ° C haciendo circular agua, y se mantiene en una atmósfera de 5% de CO 2 en una línea de gas. Las células pueden estar expuestos al humo utilizando Kentucky 3R4F de investigación de referencia cigarrillos con filtro (El Instituto de Investigaciones del Tabaco de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY). Normalmente, las células están expuestas al humo de 1 a 2 cigarrillos, produciendo 100 a 200 mg / m 3 de material particulado total (TPM). Control de las culturas están expuestos al aire ambiental para un período de exposición equivalente. </li><li> La TPM se mide de acuerdo con el protocolo del fabricante suministra con el TE-10c máquina de fumar (Empresas Teague). En resumen, un filtro (Pallflex) se coloca en un soporte de acero inoxidable en línea en un tubo de muestreo que va desde el puerto de muestreo en la cámara de ahumado a una bomba de caudal constante (unidad de muestreo). Un tubo de salida se conecta la unidad de muestreo a un medidor de gas (medidor de gas seco, ONM61, de 67 años, AEM). El filtro se pesa antes y después del muestreo de gas. El total del material depositado en el filtro en mg se normaliza el volumen total de aire muestreado. </li><li> Las células se pueden cosechar en cualquier momento (es decir, 0-24 horas) después de la exposición a nivel celular procedimientos analíticos (por ejemplo, Western inmunoblot análisis, análisis de ARNm, etc) o microscopía (es decir, la microscopía confocal o electrónica). Los medios de cultivo también pueden ser analizados por las citocinas o la liberación de LDH de los ensayos de citotoxicidad. </li></ol> 4. Resultados representante Éxito en el aislamiento del epitelio, proliferación y diferenciación en ALI debe producir una monocapa intacta, con una morfología de adoquines. Resistencia de las células Transepithelilal de culturas sanas debe ser de aproximadamente 1000-2000 Ω / cm 2. La figura 2 muestra una monocapa de ratón las células epiteliales respiratorias manchadas de células epiteliales y los marcadores de los cilios en condiciones de control y después de la exposición al humo de cigarrillo. La Figura 3 muestra micrografías de electrones representante de las culturas saludables MTEC, que representan la morfología y ultraestructura ciliar. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Preparación del producto las células epiteliales a través de tres fases, una etapa de aislamiento, una etapa de propagación, y una etapa de diferenciación en la interfaz aire-líquido (esquema). Las células epiteliales están aislados de ratón tráquea, sembradas en transwells donde proliferan en cultivo sumergido, y luego se convierte en la interfaz aire-líquido donde se diferencian totalmente. Los experimentos se suele realizar de los 24 días de cultivo continuo. La imagen muestra un sistema modelo de la exposición de las células en cultivo al humo del cigarrillo convencional. Un sistema de Transwell ALI cultura se coloca dentro de un sistema personalizado de entrega modular el humo del cigarrillo, que es controlada por temperatura, humedad y CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 cultivos de células epiteliales fueron fijadas y teñidas de núcleos (Hoechst 33258), F-actina (verde, Alexa-Fluor faloidina 488-conjugado). Y el marcador de los cilios α-tubulina acetilada (rojo, Cy3-anticuerpo secundario conjugado). Los paneles inferiores muestran imágenes equivalentes de las células epiteliales tomadas 4 horas después de la exposición al humo del cigarrillo (2 cigarrillos, 150 mg / m 3). (B) La lactato deshidrogenasa (LDH) se midió la liberación en el medio basal de 24 horas después de la exposición a diferentes dosis de humo de cigarrillo, como se indica. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Aire-líquido interfaz culturas de las células epiteliales aisladas del epitelio traqueal del ratón se diferencian en varios subtipos que por microscopía electrónica de transmisión (TEM) tienen las características de las células ciliadas, basal, y no ciliadas-1. Estas células del epitelio respiratorio seudoestratificado tipifican. Las etiquetas de la figura corresponden a: bb: basal, a: axonema, m: n las mitocondrias,: núcleo, s: sustrato (policarbonato membrana), mv: microvili

<ol>
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El protocolo que describe el aislamiento de las células epiteliales de ratón traqueal es una adaptación de los protocolos de You et al., 1, 2.3 y otros con modificaciones. Como con cualquier protocolo que describe aislamientos de células, el aspecto más importante es evitar la contaminación de bacterias u hongos patógenos mediante el uso de técnicas asépticas estrictas. Un segundo paso crítico es evitar la contaminación de fibroblastos de las culturas, que puede ser evitado por una cuidado...

* La máquina de fumar cigarrillos es una costumbre diseñado y fabricado de 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;de doble cámara y la camisa de agua a prueba de coloración clara luz 1 / 2&quot; de espesor de policarbonato Lexan de cámara para la exposición al humo de cigarrillo, con control de temperatura del sensor, el nivel del agua controlado apagado del sistema. Un hábito de fumar cigarrillos / soplar la unidad se ha instalado un cigarrillo fumando tasas variables. Cuando la unidad está en uso, que imita a una incubadora en el sentido de que la temperatura, la humedad y el dióxido de carbono son controladas en el sistema. El sistema incluye: (i) una medida de doble cámara de agua / unidad de camisa, que mantiene un ambiente controlado para los experimentos de cultivo de tejidos. (II) La obligación digitales pesado, de alta precisión de doble bomba de agua la temperatura del sistema con sensor de recirculación de agua de nivel y temperatura (III) Una unidad de consumo de cigarrillos y fumando de la bomba. (IV) Un ciclo de la bomba sensor de control de la frecuencia termociclador (IV) de precisión de acero inoxidable de alta en la línea de soporte del filtro. (V) Una tapa desmontable montado 11 / 2 &quot;tamaño de un cigarrillo uniformidad axial del ventilador de humo mezclado. (VI) Un baño de tamaño medio de agua con soporte de montaje para la recirculación de agua. (VII) A 1 / 2&quot; bandeja de acrílico de espesor con soportes para la soplo de la bomba y el soporte para el colector de cenizas de cigarrillos. Esta máquina como se describe se puede sustituir con máquinas de fumar similares disponibles en el mercado, tales como el tipo disponible de sistemas de TSE ( <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido (ALI) como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional (SC), con el fin de estudiar las respuestas de las células epiteliales a la exposición al CS. El protocolo consta de tres partes: el aislamiento de las células epiteliales de las vías de ratón tráquea, el cultivo de estas células en la interfase aire-líquido (ALI) como totalmente diferenciadas las células epiteliales, y la entrega de corriente calibrada CS de estas células en cultivo. El sistema de cultivo ALI permite la cultura de los epitelios respiratorio en condiciones que se asemejan más a su entorno fisiológico que los sistemas normales de cultivo líquidos. El estudio de las respuestas celulares y moleculares de pulmón a la exposición al CS es un componente crítico de la comprensión del impacto de la contaminación del aire ambiental en la salud humana. Resultados de la investigación en esta área en última instancia, pueden contribuir a la comprensión de la etiología de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y otras enfermedades relacionadas al tabaco, que representan a los principales problemas de salud global.

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento, el cultivo y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional, con el fin de estudiar la respuesta molecular a esta toxina ambiental.

Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Investigación

Medicina

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

Comparación de los efectos del vapor de cigarrillo electrónico y el humo del cigarrillo en una novela<em&gt; In Vivo</em&gt; Sistema de exposición

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.