このプロトコルは、複数の用途を持つ可能性のあるマウスから高純度の内皮細胞を単離および培養するための信頼性が高く再現性のある方法を実証しています。この技術は、内皮細胞の収量と純度を維持するより簡単な方法です。手順を実演するのは、私の研究室のスタッフ研究員であるニーナ・グエンです。
まず、磁気ビーズを数秒間ボルテックスします。50マイクロリットルのビーズをCD31およびCD102用の2本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。1ミリリットルのビーズ洗浄バッファーを加え、よく混ぜます。
チューブを磁気分離器の上に置き、ガラスパスツールピペットで上清を除去します。ビーズを50マイクロリットルのビーズ洗浄バッファーに再懸濁します。次に、ビーズ50マイクロリットルごとに5マイクロリットルまたは2.5マイクログラムのCD31またはCD102抗体を追加します。
ビーズ懸濁液を、端部ローテーター上で穏やかに回転させて、摂氏4度で一晩、または室温で3時間インキュベートします。イムノビーズを4回洗浄した後、イムノビーズを50マイクロリットルのビーズ洗浄バッファーに再懸濁します。分離当日、25ミリリットルのHBSSを25ミリグラムの1型コラゲナーゼに加え、穏やかに回転させながらインキュベートします。
次に、22マイクロメートルのフィルターを使用してろ過します。生後5〜7日のマウスの子犬を安楽死させた後、枝肉に70%エタノールをスプレーします。次に、胸部の側壁全体に沿って横隔膜を上向きに切り、胸腔を露出させます。
肺が白くなるまで、5ミリリットルの冷たいDMEMを心臓の右心室に注射します。次に、対応する気管支の遠位葉を1つずつ切断して、肺を取り除きます。20ミリリットルの氷冷基礎培地があらかじめ充填された50ミリリットルの円錐形のチューブで肺葉を引っ張ります。
チューブを手で10〜15秒間静かに攪拌して、余分な赤血球を洗い流します。セルストレーナーで培地から肺を取り除き、滅菌ハサミでミンチします。ミンチ組織を、25ミリリットルの予熱したコラゲナーゼ溶液と共に50ミリリットルの円錐管に移します。
回転ミキサーで静かに攪拌します。20ミリリットルの注射器を15ゲージの鈍いカニューレに取り付け、細胞懸濁液に10〜15回泡立てずに懸濁液を激しく粉砕します。懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に濾過する。
次に、消化に使用した円錐形のチューブとセルストレーナーを15ミリリットルの基礎培地ですすいでください。細胞懸濁液を摂氏4度で400倍Gで8分間遠心分離する。ペレットを2ミリリットルの完全培地に再懸濁します。
8ミリリットルの完全培地を加えてインキュベートします。翌日、カルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSでフラスコを2回洗浄し、10ミリリットルの完全培地を加えます。細胞が90〜95%コンフルエントになると、一次イムノビーズ単離の準備が整います。
付着した内皮細胞をカルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSで2回洗浄します。2ミリリットルのトリプシンフリー細胞剥離溶液を加え、それをインキュベートして、フラスコからすべての細胞を確実に持ち上げます。8ミリリットルの基礎培地を追加します。
次に、細胞を室温で4分間400倍Gでスピンダウンし、2ミリリットルの基礎培地に再懸濁します。ボルテックス抗CD31コーティングビーズを数秒間、ビーズを再懸濁させた。細胞懸濁液2ミリリットルごとに30マイクロリットルのビーズを加え、蓋をしっかり閉めます。
チューブをエンドオーバーエンドローテーターで室温で10分間インキュベートします。次に、チューブを磁気分離器に2分間置きます。上澄み液を吸引し、磁石からチューブを取り外します。
3ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、数回上下にピペッティングして、ビーズ細胞ペレットを再懸濁します。磁気分離器のチューブを2分間交換します。その後、ガラス製パスツールピペットを用いて上清を注意深く吸引する。
最終洗浄後、上清が透明になったら、ビーズ細胞ペレットを3ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁し、T75フラスコに移します。7ミリリットルの完全増殖培地を加えてインキュベートします。翌日、カルシウムとマグネシウムを含まないHBSSで細胞を再洗浄します。
次に、10ミリリットルの完全培地を追加します。細胞が90〜95%コンフルエントになると、二次イムノビーズ単離の準備が整います。最初のイムノビーズの選択は、石畳の形成で成長するCD31陽性細胞を識別します。
抗CD102コーティングビーズを用いた2回目のイムノビーズ選択は、内皮細胞の純度を高め、蛍光活性化セルソーティングを使用して、細胞集団がCD31陽性およびCD102陽性であることを確認する。内皮炎症経路と内皮バリア機能を研究するために、マウスCytomixによる処理を使用して、P値が0.01未満の内皮細胞による有意なIL-6産生を誘導しました。さらに、経内皮抵抗は減少し、内皮透過性の増加を示した。
単離された内皮細胞は、内皮細胞刺激またはバリア機能アッセイにおいて、内皮機能障害に対する内皮ベースの治療標的を発見するために使用することができる。
