AHA GIA0855953G、NIH 1R01 HL091105 - 01：この作品は、SMMへの補助金によって賄われていた。追加のサポートされていました：DW：NIH RO1DK075013、DDKとKleberg財団、UCCCフローサイトメトリーコア（NIH 5 P30 CA 46934〜15）、UCCCマイクロアレイコア（NCI P30 CA 46934〜14）。

1。肺の分離<ol><li>無菌テクニックを使用して放血が続くイソフルランの過剰摂取によるマウス成体マウス（; 18〜20グラムC57Bl6J年齢8〜10週）を生け贄に捧げる。プロファイルには、菌株間でわずかに異なります。 </li><li>外科的にダイヤフラムを削除する、マウスの各側面に横方向に胸郭を切断することにより胸腔を開く。優しくリン酸の3 - 5mlsを使用して、右心臓の心室を灌流することによって肺から血液をフラッシュには生理食塩水（PBS）を。 </li><li> （HBSS）緩衝生理食塩水ハンクスで満たされたペトリ皿で​​気管と大きな気管支と場所を削除する肺葉を解剖。すべての肺葉の鉗子の次のコレクションは、皿の蓋の上に組織を置くために使用されます。組織は、それらが浮くと移動するほど、それらは湿ったではなく、維持するのに十分な液体で使い捨て外科用メスを用いて小さな部分に刻まれて。 </li><li>マウスの一つの後肢を摘出し、FLOを設定するには、染色のコントロールとして使用するために骨髄を分離ワットメトリーゲート。前述1に記載の骨髄（BM）を染色。 </li></ol> 2。肺組織からの単細胞懸濁液の調製<ol><li> 、滅菌HBSSに溶解したワーシントン2型コラゲナーゼ（猫＃LS004202ワージントンの生化学、レイクウッド、ニュージャージー州）は、予め温めておいた0.2％の5mls：各肺は、0.2グラムの体積比に最適化された組織の重量を用いて消化する。混合物を30分間2,3に対して37℃の水浴中に浸漬される。 </li><li>肺組織のダイジェストが10ミリリットルピペット（約10回の繰り返し）を介して容易に流れるまで、よくサンプルを砕いて粉にする。 37℃でさらに15分間インキュベート° Cは、組織がより均一な単一の細胞懸濁液を消化し、確実に完了する。 </li><li> HBSSによる肺の細胞懸濁液を希釈し、残存組織の断片を分散させるために5ミリリットルピペットでひいて粉にする。 </li><li>未消化の組織片を除去するために70μMセルストレーナーを使用してサスペンションをフィルタリングする。サンプルはmultiplに分けることができます。一つのセルストレーナーの過負荷を防止し、時間を短縮するためにこの時点でeはコニカルチューブ。 </li><li>ペレット1500rpmでと上清をデカントで10分間、細胞懸濁液。 </li><li> 5分間室温でインキュベート、再懸濁し、細胞ペレットを穏やかに室温RBC溶解バッファー（猫＃00-4333-57 eBiosciences、サンディエゴ、CA）を使用。溶解バッファーを不活化し、破片と細胞の凝集物を除去するために40μmのセルストレイナーを使用して細胞懸濁液をフィルタするためにHBSSの等量を追加。 </li><li>各サンプルのピペット10μLが煤けると肺と血球計数器を用いてBM試料の両方の細胞数をカウントする。注：セルの合計量を記録する。 </li><li>ペレット10分間1500rpmで遠心分離による肺細胞の単一の細胞懸濁液。 </li><li>猫＃11965-092）を含む2％ウシ胎児bovi、温めておいたで1 × 10 6細胞/ ml（37℃）DMEM +（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州はで肺と骨髄細胞の両方を再懸濁しますNE血清（FBS）および10mMのHEPES。 </li><li>ヘキスト33342色素（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ、猫＃B2261）の1mg/mlのストック溶液の準備水のをと1,4を殺菌フィルタ。ヘキスト染料は、-80℃でアリコートとして格納されることがあります</li><li>単一の細胞懸濁液に5μg/mlの最終濃度（1mg/mlの株式の200倍希釈）にHoescht 33342染料を追加。 </li><li> 37正確に90分間° Cの水浴中で穏やかに反転し、インキュベートして細胞を混ぜる。 </li></ol> 3。染色とフローサイトメトリー分析のための肺の細胞懸濁液の調製<ol><li> 90分後にヘキスト染色した肺の細胞を持つすべてのステップは、色素流出を防ぐために、4℃または氷上で実行する必要があります。 4℃で10分間1500rpmで遠心分離によってペレットは、細胞℃、氷冷染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）で細胞を再懸濁する。 </li><li> 2％含有するPBSの300 -600μl使用しない以上の7 × 10以上の細胞/チューブの濃度で再懸濁し、細胞FBSと10mMのHEPES。 </li><li> 。肺とBM試料の猫＃559864）氷上で10〜15分間インキュベート中に非染色制御を含む;。十分にCD45抗体を（通常はCD45 - APC（BD Pharmingen社、サンディエゴ、カリフォルニア州の1:200希釈tittered追加実験手順は、分析のゲートを設定すると便利です。 </li><li> 4で、細胞をペレット化する° C、1500 rpmで5分間。チルド染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）500μlの上清と再懸細胞をデカントします。 （;猫＃14から956 - 1D Fisherbrand、イリノイ州シャンバーグ）予冷したスナップキャップポリプロピレンチューブに移す。 </li><li>死細胞を除外するために2μg/mlの最終濃度試料にヨウ化プロピジウム（PI、PBSで200μg/mlの株式）を追加します。 PIは、フローサイトメトリー解析の際に正しい蛍光プロファイルを達成するためにヘキスト33342色素と組み合わせて使用​​する必要があります。 </li><li>フローサイトメトリー分析まで、光から保護チューブを氷中に、保管してください。 </li></ol> 4。定義と分離するフローサイトメトリー分析サイドポピュレーション（SP）を検出するためのヘキスト色素流出を使用して肺間葉系幹細胞（肺MSC）人口<ol><li>このアッセイは、以下の機器の要件があります。 </li><ul><li> 488 nmのとUV（350〜355 nm）のレーザー</li><li>青（65分の450）と赤（50分の675）フィルターとUVレーザーのパス上の2検出器。 </li><li> UV赤検出器は、赤の信号のための高感度を持っている必要があります。これは古いセルソーターによる問題である可能性があります。 </li><li> 50から10にサンプルを維持するためにチラーユニット℃に</li></ul><li>レーザーの位置を合わせ、製造業者のプロトコルに従って細胞選別のために設定する。 </li><li>赤（x軸）と青（y軸）リニアスケールを使用してヘキスト信号を収集する。 </li><li>トレーリング側の人口の適切な表示を可能にするために、プロット上の中心の右上にG0/G1ピークを配置する光電子増倍管の電圧を調整します。細胞周期のS期とG2全体の部分は、プロットの右上にオフスケールの可能性があります。青SIG赤の信号が暗いしながら内部は比較的明るいです。典型的なMoFlo XDP（ベックマンコールター、マイアミ、フロリダ州）の電圧は青のための425および赤色650です。 </li><li>死細胞は、PIを用いてゲートです。標準のPIのパス（励起488nmの、放射630nm）を用いることができる。また、PIはplot（SP）UVレーザーで励起し、死細胞集団は、オフスケールは、サイドポピュレーションの右側に位置しています。これは、FITCやPEなどの他の蛍光色素からPI信号を補正する必要がなくなります。オリジナルのグッデルの方法は5-7後者手順を追った。 </li><li>分析中に、比較的低い圧力差を維持し、サイドポピュレーションのタイトな解像度を確保するためのソート。 </li><li> SPは、肺の細胞の主要な集団から離れてサイドアームとして表示されます。この人口は、ヘキストローと呼ばれます。 </li><li>ヘキスト低 / SPは、ヒストグラム2,3（Fを用いてCD45陽性および陰性集団を分離するために分析されigure 1）。 </li><li>ヘキスト低い CD45 NEG肺MSCの人口の選定およびゲーティングに続いて、細胞を96ウェルプレート3にクローンを単離するためにチューブまたは、単一の細胞にいずれかの混合集団としてソートすることで収集されることがあります。 </li><li>プレートは、ソートのストリームのたわみをソートするため、通常はチューブのソートに使用するよりも縦のソートのストリームを作成するために25％に調整されます。 </li><li>左上にテストストリームのパルスを送信し、96ウェルプレートのウェル右下でソートストリームを目指しています。 </li><li>各ウェルに希望のセル数を堆積させるソーターのソフトウェア板のマップを設定します。 </li><li>単一の細胞クローンを単離するために、単一の肺のMSCは培養培地の150μL（α- MEM 20％FBSを添加した）に96ウェルプレートのウェルにソートされます。ソート後培地の追加の100μlのが追加されます。 </li></ol> 5。肺MSCとクローンの単離、培養および特性評価<ol><li> Culturソートは、次の電子との混合肺のMSCの人口と、単一の細胞クローンの拡大は、標準的な培養条件を用いて同じです（37℃、5％CO 2および&gt; 95％湿度）。細胞は16時間以下の分離を付着させています。メディアは、（α- MEM 20％FBSを添加した）、48時間毎に置換されます。ときに細胞がより急速に増殖し、それらが継代されている75から80パーセントの合流点（図2）の間に到達し始める。 </li><li>細胞を温めておいたHBSSでリンスし、0.5％トリプシン/ EDTA（Cellgro、マナサス、バージニア州、猫＃25 - 053 - Cl）とインキュベートする37℃で2分未満のためのC。細胞は、細胞懸濁液の外観を確認するために反転範囲を使用して監視されます。 </li><li>肺MSCは、文化の現在の増殖速度に応じて1:2または1:3の比率で分割されます。 </li><li>伝統的な間葉系脂肪細胞や軟骨細胞、骨芽細胞の系統、と受け入れられる間葉系マーカーの彼らの細胞表面発現に分化するために肺のMSCの能力Isは、それぞれの細胞調製のために評価した。細胞遺伝学的バンド分析も総染色体異常2,3,8-11の不在を確認するために実行されます。 </li></ol> 6。コロニー形成アッセイを使用して肺のMSCの列挙（CFU - F） <ol><li> 1 × 10 6細胞/ mlの最終濃度に完全MesenCult媒体（幹細胞技術、バンクーバー、BC）で細胞を希釈する。 </li><li>メディア10mlの中の6 × 10 4細胞、3 × 10 4細胞、1.5 × 10 4細胞を、0.75 × 10 4細胞の100mmディッシュの最終濃度を達成するために段階希釈を行います。分析は、それぞれの細胞濃度のために重複したり、三連で行われており、小さな表面積に比例してスケールアップすることができる。 </li><li>標準的な条件下で10日間の培養細胞。日に10細胞をPBSで洗浄し、室温で5分間、100％メタノールを使用して固定されています。 </li><li> 0.4パーセントw / vのギムザ染色液で染色によりCFU - Fのコロニーを検出する（シグマケミカル株式会社、セントルイス、MO）脱イオン水で1:20に希釈。空気乾燥して試料を許可し、コロニー当たり25細胞（図3）よりも大きいを含むコロニーの数を定量化する。 </li></ol> 7。 T細胞の増殖とアポトーシスに対する肺のMSCの免疫調節特性の解析<ol><li>ウェルあたり6.25x10 4肺のMSCの細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩2を放置している。 </li><li> CD4 +卵白323〜339ペプチドを認識するT細胞とT細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウス、OT - IIの脾臓から細胞、CD8を枯渇させることによって精製されている+、CD19 +、MHC - II +およびCD25 +細胞と国内でのみ有効AutoMACSセルソーター（ミルテニー、オーバーン、カリフォルニア州）。抗原提示細胞（APC）は、積極的にMHC - II +細胞12をソートすることによって分離されています。 </li><li> APCは、4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS / 5％BSA/2mM EDTAで3回洗浄し、0.5μg/mlまたは5μg/ mでロードされますリットルOVA323ペプチド。 </li><li>シミュレートされた、APC逮捕成長を96ウェルプレートでの肺のMSCに追加されます。 </li><li> 95％以上の純粋なCD4 + 1 × 10 5細胞は5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE、シグマ、セントルイス、MO）で標識されているPBSで、暗所で5分間インキュベートし、PBS - 5％BSAで洗浄し、その後に追加DMEM 5％FBS培地でAPCと肺のMSC細胞。その後、細胞を96時間インキュベートする。 </li><li> CD4（APC - Cy7）; CD8（ViolBlue）、T -細胞は、抗抗CD40（Cy5）で染色されるVbeta 5（PE）と国内でのみ有効MacsQuant 7チャンネルのフローサイトメーター（ミルテニー、Aurburn、CA）とを用いてアッセイFloJo解析ソフトウェア（Treestar、オレゴン州アッシュランド）。増殖は背景に比べて、T細胞はCFSEで標識し、APC（図4）にさらされていないCFSEの蛍光強度の平均の減少として測定されます。 T -細胞はトリパンブルー排除で評価この時間と生存率にカウントされます。 </li></ol> 8。代表的な結果： 図1フローサイトメトリー分析および肺のMSCの定義 。肺組織ダイジェストの単一の細胞懸濁液は、Hoechst 33342で染色し、違いを検出するフローサイトメトリーによって分析されています。前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）とB。ヘキスト青色と赤色蛍光。サイドポピュレーション（SP）の存在は、ゲートに表示されます。ヘキスト低い SPは、次にCを分離するために分析されます。肺のMSCのCD45 陰性人口。肺SPの負の比率に正のCD45は、一般的に70:30 / 60:40です。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="図2"/> 図2肺MSCの単離と文化 。細胞選別により、肺のMSCのコレクションに続いて、細胞は、α- MEM supplemを使用して30ミリメートル皿にプレートされています20％FBSを取得済み。。新しくソートされた細胞は、小さな丸いと明るく表示されます。B。間葉系の表現型を有する約2〜3週間のコロニー後に明らかになると増殖がより明らかです。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。コロニー形成、線維芽細胞アッセイによるMSCの列挙。拡大肺MSCは、A.は、10日後。CFU - Fアッセイ用に記述されているプロトコルごとに播種し、ギムザ染色コロニーは明らかですしている。B.のコロニーが大きくなるとで構成される数百個の細胞。C.細胞が間葉系の表現型を表示します。 ＆B、スケールバー= 0.5センチメートル、Cのスケールバー= 0.14センチメートル。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。CFSEベースのT細胞増殖アッセイ 。肺のMSCとantigeの存在の有無にN提示細胞（APC）+ / -オボアルブミン（OVA）CD40 ポジティブエフェクターT細胞は、（赤い丸）の増殖を示すCFSEの強度の減少を示しています。 T -細胞膜のCFSEの蛍光強度はすべての細胞分裂の例で化学量論的に減少する。すべての分裂と。肺MSC、APC + /の存在下で- OVA、CD40 正のエフェクターT細胞の増殖（赤い円）が不足していることを示すCFSEの強度には有意な変化を示さない。

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation.">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li><li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li><li>Majka, S. 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利害の衝突は宣言されません。

我々は当初、居住者の肺のMSCの特定の集団を単離するためにBM造血細胞を識別するために使用される手法を適応している。分離の再現性に起因するこれらの細胞は、その後もMSCとして特徴づけられた。その起源は、成体マウスの肺における居住者（のような派生BMとは対照的に）と2を文書化表現型と分子プロファイルとして定義されています。繰り返しこの特徴集団を単離する能力は、組織の恒常性と疾患の間に肺のMSCの生物学的重要性と役割のさらなる研究が可能になります。マウスとヒトの両方の肺組織のin vivoでのこの集団の最近の定義は、傷害と疾病の間に肺の修復を促進する内因性細胞の救出に向けられた治療戦略の開発を容易にします。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td>シグマ</td><td> P - 5368 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクスは、塩溶液（HBSS）をバッファ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.2パーセントワーシントン2型コラゲナーゼ</td><td>ワージントンの生化学</td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td>赤血球の溶解バッファー</td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td>ヘキスト33342色素</td><td>シグマ</td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45 - APC </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> - MEM </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.5パーセントトリプシン/ EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25から053 - Clを</td><td></td
></tr><tr><td>完全なMesenCultミディアム</td><td>セル技術を幹</td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.4パーセントw / vのギムザ染色液</td><td>シグマ</td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td> 15710 </td><td> 16％paraformeldehydeは、PBSを用いて、4％に希釈され</td
></tr><tr><td>カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE） </td><td>シグマ</td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

組織の居住者間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復や再生、線維症、炎症、血管新生と腫瘍形成の重要な調節因子である。これらの研究は、居住者の肺のMSCは、このような肺線維症（PF）と動脈性高血圧症（PAH）などの疾患時の肺組織の恒常性、損傷および修復の間に役割を果たすことを示唆して一緒になって。ここでは、居住者の肺のMSCの人口を定義するために技術を説明します。この人口の定義は、in vivoでのマーカーのセットを定義を使って肺組織では、フローサイトメトリーおよび特定の細胞型と機能の研究により、十分に特徴付けられた幹細胞集団の繰り返し分離を容易にします。

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

この記事では、マウスの常駐肺間葉系幹細胞（肺MSC）、それらの拡大、特性評価および免疫調節特性の分析の分離を示しています。

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K ビュー.  University of Colorado Denver. この記事では、マウスの常駐肺間葉系幹細胞（肺MSC）、それらの拡大、特性評価および免疫調節特性の分析の分離を示しています。

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Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

生物学

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

マウス唾液腺幹細胞の単離

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...