Este trabalho foi financiado por doações de SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Apoio adicional foi fornecida por: DW: NIH RO1DK075013, DDK e da Fundação Kleberg; o Core Citometria de Fluxo UCCC (NIH 5 P30 CA 46934-15), o UCCC Microarray núcleo (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolamento de pulmão <ol><li> Sacrifício ratos adultos (80-10 semanas de idade; 18-20 g; C57Bl6J) ratos com uma overdose de isoflurano seguido de sangria utilizando técnica estéril. Perfis variam ligeiramente entre cepas. </li><li> Remover cirurgicamente o diafragma, abrir a cavidade torácica, cortando as costelas lateralmente em cada lado do mouse. Lavar o sangue dos pulmões irrigando o ventrículo direito do coração delicadamente usando 3-5mls de tampão fosfato (PBS). </li><li> Dissecar os lobos pulmonares remoção traqueia e os brônquios grandes e coloque em um prato de petri preenchida com solução salina Hanks (HBSS). Após a coleta de todos os lobos pulmonares pinças são usadas para colocar o tecido sobre a tampa do prato. Tecido é então picada em pedaços pequenos utilizando bisturis descartáveis ​​com líquido suficiente para mantê-los úmidos, mas não tanto que eles flutuam e se mover. </li><li> Dissecar um membro posterior de um dos camundongos e isolar a medula óssea a ser usado como um controle de coloração para definir o flow citometria de portas. Mancha da medula óssea (BM) como descrito anteriormente 1. </li></ol> 2. Preparação de uma suspensão de células do tecido pulmonar Único <ol><li> Cada pulmão é digerido usando um tecido de peso otimizado para relação de volume de 0,2 g: 5mls da pré-aquecido 0,2% Worthington tipo 2 colagenase (Bioquímicos Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissolvida em HBSS estéril. A mistura é imersa em um banho de água 37 ° C por 30 min 2,3. </li><li> Triturar amostra bem até digerir tecido pulmonar flui facilmente através de uma pipeta de 10ml (aproximadamente 10 repetições). Incubar por 15 minutos adicionais a 37 ° C para completar o tecido digere e garante uma suspensão de células mais uniforme único. </li><li> Diluir a suspensão de células de pulmão com HBSS e triturar com uma pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos de tecido residual. </li><li> Filtrar a suspensão utilizando um coador de células 70μM para remover fragmentos de tecido sem serem digeridas. Amostra pode ser dividida em multipltubos cônicos e neste ponto para evitar a sobrecarga um coador de celular e diminuir o tempo. </li><li> Pellet da suspensão de células por 10 min a 1500 rpm e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender pellet celular usando delicadamente a temperatura ambiente RBC tampão de lise (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubar a RT por 5 min. Adicionar um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise e filtrar a suspensão de células usando um coador de células 40μM para remover detritos e agregados celulares. </li><li> Pipetar 10μl de cada amostra a ser manchada e contagem de números de celular tanto para o pulmão e as amostras usando um hemocitômetro BM. Nota: registrar o volume total das células. </li><li> Pellet a suspensão única célula de células do pulmão por centrifugação a 1500 rpm por 10 min. </li><li> Ressuspender tanto pulmão e células BM em 1x10 6 células / ml no pré-aquecida (37 ° C) DMEM + (meio modificado Dulbecco Águia, glicose elevada (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092), contendo 2% Bovi fetalne soro (FBS) e HEPES 10mM. </li><li> Prepare uma solução estoque 1mg/ml de Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) em água e filtro de esterilizar 1,4. O corante Hoechst pode ser armazenada como alíquotas a -80 ° C. </li><li> Adicionar corante Hoescht 33342 para uma concentração final de 5μg/ml (a diluição de 200x de um estoque 1mg/ml) para a suspensão única célula. </li><li> Misture delicadamente as células por inversão e incubar em banho-maria 37 ° C por exatamente 90 minutos. </li></ol> 3. Coloração e preparação da suspensão de células do pulmão para a Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Depois de 90 min todos os passos com as células do pulmão Hoechst manchado deve ser executado a 4 ° C ou em gelo para evitar efluxo corante. Agregar as células por centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4 ° C e ressuspender as células em ice-cold coloração tampão (PBS 2% FBS). </li><li> Ressuspender as células em uma concentração não superior a 1x10 7 células / tubo com 300-600μl de PBS contendo 2%FBS e HEPES 10mM. </li><li> Adicionar tituladas de forma adequada de anticorpos CD45 (tipicamente 1:200 diluição de CD45-APC (BD PharMingen, San Diego, CA; cat # 559864) para o pulmão e as amostras BM Incubar no gelo por 10-15 min Incluindo um controle durante a imaculada.. procedimento experimental é útil para definir os portões análise. </li><li> Células pelota a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 mL de tampão coloração refrigerados (PBS 2% FBS). Transferência para prechilled pressão tubos de polipropileno cap (Fisherbrand, Schaumburg, IL; cat # 14-956-1D). </li><li> Adicionar iodeto de propídio (PI, 200μg/ml de ações em PBS) para as amostras para uma concentração final de 2μg/ml para excluir as células mortas. PI deve ser utilizado em combinação com o corante Hoechst 33342 para alcançar o perfil correto de fluorescência na análise por citometria de fluxo. </li><li> Tubos de armazenamento em gelo, protegido da luz até a análise de citometria de fluxo. </li></ol> 4. Citometria de fluxo para definir e isolarum Pulmão de Células-Tronco Mesenquimais (pulmão MSC) População com corante Hoechst efluxo para detectar uma População Side (SP) <ol><li> Este ensaio tem os requisitos instrumento seguinte: </li><ul><li> 488 nm e UV (350-355 nm) lasers </li><li> 2 detectores no caminho de laser UV com o azul (450/65) e (675/50) vermelho filtros. </li><li> O detector UV vermelho deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho. Este pode ser um problema com a triagem mais velhos celular. </li><li> Unidade de resfriador para manter a amostra a 50-10 ° C. </li></ul><li> Alinhar lasers e configurar para separação de células seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Recolher o vermelho (eixo-x) e azul (eixo y) sinais Hoechst, usando uma escala linear. </li><li> Ajustar as tensões tubo fotomultiplicador para colocar o pico G0/G1 no canto superior direito do centro sobre o enredo para permitir a exibição adequada da população lado de trás. Uma parte da fase S e G2 do total do ciclo celular pode ser fora de escala no canto superior direito da trama. O sig azulnal é relativamente brilhante enquanto o sinal vermelho é fraca. Típico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensões são 425 para o azul e 650 para o vermelho. </li><li> As células mortas são fechados por meio PI. O caminho padrão PI (excitação 488nm, emissão 630nm) pode ser usado. Alternativamente, PI também está animado com o laser UV ea população de células mortas está fora da escala do lado direito da população lado (SP) enredo. Isto alivia a necessidade de compensar o sinal PI a partir de qualquer outro, como fluorocromos FITC e PE. O método original seguido Goodell que estes últimos procedimentos 5-7. </li><li> Manter um diferencial de pressão relativamente baixa durante a análise e triagem para garantir a resolução firme da população lado. </li><li> A SP aparece como um braço do lado para além da população principal de células do pulmão. Esta população é denominado Hoechst baixo. </li><li> A baixa Hoechst / SP é analisado para separar as populações CD45 positivo e negativo usando um 2,3 histograma (FIGURA 1). </li><li> Após a selecção ea propagação do CD45 baixo Hoechst neg pulmão população MSC as células podem ser coletadas por triagem ou como uma população mista em um tubo ou uma única célula para isolar clones em uma placa de 96 poços 3. </li><li> Para placa de classificação do desvio de fluxo tipo é ajustada para 25% para criar um fluxo tipo mais vertical do que que normalmente usado para classificação tubo. </li><li> Aponte o tipo de fluxo através do envio de um pulso de corrente de teste para o canto superior esquerdo e inferior direito, em seguida, o poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Definir o classificador mapa da placa software para depositar o número desejado de células em cada poço. </li><li> Para isolar clones uma única célula MSC único pulmão é classificado dentro do poço de uma placa de 96 poços em 150μl da cultura da mídia (α-MEM suplementado com SFB 20%). Após o ordenar um adicional de 100μl médio é adicionado. </li></ol> 5. Cultura, isolamento e caracterização de pulmão MSC e Clones <ol><li> Culture e expansão de população mista de pulmão MSC e clones única célula seguinte classificação é idêntica usando condições de cultura padrão (37 ° C, 5% CO 2 e&gt; 95% de umidade). Células estão autorizados a aderir isolamento por 16 horas seguintes. Media é substituído a cada 48 horas (α-MEM suplementado com SFB 20%). Quando as células começam a proliferar mais rapidamente e atingir entre 75-80% confluência são várias passagens (Figura 2). </li><li> Células são lavadas com HBSS pré-aquecida e incubadas com 0,5% de tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C por menos de 2 min. Células são monitoradas através de um escopo invertida para confirmar a aparência de uma suspensão de células. </li><li> MSC pulmão são divididos então em relação 1:2 ou 1:3, dependendo da taxa atual proliferação da cultura. </li><li> A capacidade da MSC pulmão de se diferenciar em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócitos e condrócitos e sua expressão na superfície celular de marcadores aceita mesenquimais is avaliados para cada preparação celular. A análise citogenética de bandas também é realizada para confirmar a ausência de graves anomalias cromossômicas 2,3,8-11. </li></ol> 6. Enumeração de MSC de pulmão usando uma Assay Formadoras de Colônias (CFU-F) <ol><li> Diluir as células em meio MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) para uma concentração final de 1x10 6 células / ml. </li><li> Realizar diluições em série para atingir concentrações finais em um prato de 100 mm de 6x10 4 células, 3x10 4 células, 1,5 x10 4 células e 0,75 x10 4 células em 10ml de mídia. As análises são realizadas em triplicata duplicado ou para cada concentração de células e pode ser escalado para áreas menores superfície. </li><li> Células de cultura por 10 dias em condições normais. No dia 10 as células são lavadas com PBS e fixadas com metanol 100% por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Detectar as colônias CFU-F através da coloração com 0,4% de solução de coloração w / v Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluído 1:20 com água deionizada. Permitem que as amostras de ar seco e quantificar o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia (Figura 3). </li></ol> 7. Análise das propriedades imunomoduladoras de MSC em pulmão de células T-Proliferação e Apoptose <ol><li> 6.25x10 4 células pulmonares MSC por poço são semeadas em placas de 96 poços e deixar repousar 2 durante a noite. </li><li> CD4 + células de baço de t-cell receptor (TCR) camundongos transgênicos, OT-II com células T que reconhecem a ovalbumina 323-339 peptídeo, são purificados, esgotando CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + células com Miltenyi um classificador de células AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células apresentadoras de antígenos (APC) são isolados por positivamente classificação MHC-II + células 12. </li><li> APC são fixados em paraformaldeído 4%, lavados três vezes em PBS / EDTA 5% BSA/2mM, e carregado com 0.5μg/ml ou 5μg / ml peptídeo OVA323. </li><li> Crescimento, simulados preso APC são adicionados à MSC de pulmão em placas de 96 poços. </li><li> Superior a 95% CD4 + pura 1x10 5 células são rotulados com 5m carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE; Sigma, St.Louis MO) em PBS e incubadas por 5 min no escuro, lavados com PBS-BSA 5%, e então adicionado ao APC e células MSC pulmão em DMEM 5% FBS mídia. Células são então incubadas por 96 horas. </li><li> T-células são então coradas com anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analisadas usando um Miltenyi MacsQuant 7 citômetro de fluxo do canal (Miltenyi, Aurburn, CA) e Flojo análise software (Treestar, Ashland, OR). Proliferação é medida como a diminuição da intensidade de fluorescência média de CFSE em comparação com o fundo, as células T marcado com CFSE e não expostos a APC (Figura 4). As células T são contados neste momento e de viabilidade avaliada com exclusão de tripan blue. </li></ol> 8. Resultados representativos: Figura análise de fluxo 1. Citometria e Definição de MSC Lung. Suspensões única célula de tecido pulmonar digerir são corados com Hoechst 33342 e analisados ​​por citometria de fluxo para detectar diferenças em A. dispersão para a frente (FSC) e dispersor lateral (SSC) e B. Hoechst azul e vermelho fluorescente. A presença de uma população lado (SP) é visível no portão. A Hoechst baixos SP é então analisado para separar o C. CD45 negativo da população MSC pulmão. O CD45 positivo para negativo de índices de pulmão SP normalmente são 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Isolamento e Cultura da MSC Lung. Após a colheita dos MSC pulmão por separação de células, as células são banhados em pratos de 30 milímetros usando α-MEM supplemtura orientada com FBS 20%. A. Células recém-ordenados parecem pequenos, redondos e brilhantes. B. Após cerca de 2-3 colônias semanas com um fenótipo mesenquimal tornar-se evidente e proliferação é mais óbvio. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Enumeração de MSC por Assay Formadoras de Colônias de fibroblastos. Expanded pulmão MSC são banhados por o protocolo descrito para o ensaio CFU-F. A. Depois de 10 dias e colônias Giemsa são evidentes. Colônias B. são grandes e composta por um algumas centenas de células. C. As células apresentam um fenótipo mesenquimal. A &amp; B, bar Escala = 0,5 cm; C = 0,14 bar Escala cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. CFSE Baseado T ensaio de proliferação celular. Na ausência de MSC pulmão e presença de antigen células apresentadoras (APC) + / - ovalbumina (OVA) CD40 de células T efetoras positivos demonstram uma diminuição na intensidade CFSE que indica a proliferação (círculo vermelho). Intensidade de fluorescência CFSE da membrana da célula T diminui estequiometricamente com cada ou seja a divisão celular. em cada divisão. Na presença de pulmão MSC, APC + / - OVA, CD40 de células T efetoras positivos demonstram nenhuma mudança significativa na intensidade CFSE o que indica uma falta de proliferação (círculo vermelho).

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	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós adaptamos um método inicialmente utilizado para identificar BM células hematopoiéticas para isolar uma população específica de MSC pulmão residente. Devido à reprodutibilidade de isolamento dessas células foram então bem caracterizado como MSC. Sua origem tem sido definido como residente no pulmão do rato adulto (em oposição a BM derivados) e um perfil fenotípico e molecular documentada 2. A capacidade de isolar essa população repetidamente caracterizada permite que o estudo mais aprofundado da importância biológica e papel da MSC pulmão durante homeostase do tecido e da doença. A definição recente da população in vivo tanto em camundongos e humanos tecido pulmonar facilita o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica dirigida ao resgate de células endógenas para facilitar a reparação do pulmão durante a ferimentos e doenças.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Tampão fosfato (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solução tamponada de sal (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington tipo 2 colagenase </td><td> Bioquímicos Worthington </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Vermelhas do sangue tampão de lise celular </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Corante Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD PharMingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Iodeto de propídio </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Médio completo MesenCult </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v solução de coloração Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% </td><td> Microscopia eletrônica de Serviços </td><td> 15710 </td><td> Paraformeldehyde 16% é diluída a 4% com PBS </td
></tr><tr><td> Carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Tecido residente células-tronco mesenquimais (MSC) são importantes reguladores de reparação tecidual ou regeneração, fibrose, inflamação, angiogênese e formação de tumores. Em conjunto, estes estudos sugerem que a MSC pulmão residentes desempenham um papel durante a homeostase do tecido pulmonar, lesão e reparo durante doenças como a fibrose pulmonar (PF) e hipertensão arterial (HAP). Aqui nós descrevemos uma tecnologia para definir uma população de MSC pulmão residente. A definição desta população no tecido pulmonar vivo usando um conjunto de definir marcadores facilita o isolamento repetido de uma população bem caracterizados com células-tronco por citometria de fluxo e do estudo de um tipo específico de célula e função.

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K visualizações.  University of Colorado Denver. Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Vídeo: Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biologia

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Isolamento, caracterização e alto Throughput análise de fluxo extracelular de Mouse primária Renal Tubular as células epiteliais

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...