この研究は、助成金なしで賄われていた。全米科学財団から0723341（KGLまで）。我々はまた、シャピロ学部研究フェローシッププログラムとランドルフ - メイコン大学で心理学科が提供するの貢献に感謝しています。最後に、我々はこの研究ではクレイグマラキンスリーの共同の貢献に感謝し、このビデオの記事のためにR - MCの実験室を準備するのアマンダRzucidloのヘルプを参照してください。

1。動物モデルの同定<ol><li>カリフォルニア州の鹿マウス（Peromyscusカブリダニは ）父親の反応を探索するのに理想的なモデルです。ご覧のようにお母さんと同じように、このマウスは、子犬をグルーミング - 彼らも、子犬が授乳のようにそれが見えるようにそれらの上にしゃがま。カリフォルニアのマウスの動作は同じ属に、多くの場合、エスケープするかも、それらを攻撃しようとして、子犬にはほとんど関心を示す一般的なシカのマウス（Peromyscus maniculatus）の種と比較されます。 （子犬との相互作用これらの種の写真を図1を参照してください。） </li><li>種のモデルが特定されたらその後さまざまなグループを確立する必要があります。本研究では、生物学的な父親、ない子育ての経験を持つ処女、および両種の限られた子犬露出（PUP -露出またはフォスター父親）との処女がかかりやすいと買収の両方父方の特性を評価できるようにするために使用されます。この特定の研究で我々はまた、社会的相互作用は、ケージに入れ、何にでも子犬としない代表的な応答に特異的であることを保証するために子犬のおもちゃのマウスへのすべてのグループを露出し（図2を参照してください。） </li><li>神経生物学的要因を調査する前に、それは選択された種は、関心の動作の明確な違いを示すことを確認することが重要です。本研究では、男性は5分と父性行動のエソグラムのための子犬をケージに入れている（エソグラムの例については、表1を参照）と接触して過ごした子犬と時間の量に近づくために待ち時間などの行動を獲得するために使用されます子犬。積極的な反応が認められた場合には、子犬はすぐに削除されます。慎重な行動分析が続いて実施できるよう、これらのセッションは多くの場合、ビデオテープに録画されています。 </li></ol> 2。脳組織の準備<ol><li>各マウスの標準灌流（添付のプロトコル）に続いて、脳はそれらが関心の特定の領域（ショー脳）に区分することができるように削除されます。 </li><li>バソプレシン（AVP） - 標準的なマウスの脳アトラス（地図アトラス）は視床下部の室傍核、本研究への関心の神経ペプチドを産生する細胞が豊富であることが知られている領域を見つけるために使用されます。 </li><li>組織はミクロトームで切片化される前にフリーズするように、脳は、ブロックし、凍結チャックに装着される。特定のランドマークが識別されるまで、脳がトリムモードに区分される、その後、特定の脳の厚さが、この場合は30ミクロンは、解析に用いる脳切片のために設定されています。 </li><li>脳切片を慎重にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填したウェルプレートに配置され、（添付のPBSのためのプロトコルが、これは標準的な免疫プロトコールの一例であることに注意してください）​​。 </li></ol> 3。免疫細胞化学<ol><li>このプロセスの様々な手順（添付のプロトコールを参照）を通して、それは化学物質と、このテクニックのための重要な他の成分の正確な測定を（学生のピペッティングを表示）確実に正確なピペッティングのスキルを持つことが重要です。 </li><li>このプロセスの最初のステップは、ウェルプレート3〜5倍にPBSを置換などの脳を洗浄され、各洗浄の間にウェルプレートを10分間ロッカーに置かれている（学生はPBSを交換し、ロッカーにウェルプレートを配置することを示す） 。 </li><li>脳スライスは、一次抗体溶液に暴露し、ロッカー（ショープロセス）で℃で一晩4℃で保存されます。 </li><li>別の洗浄に続いて、脳のスライスを再度洗浄し、室温でロッカーで1時間二次抗体にさらされている。 </li><li>次に、脳を神経化学的陽性細胞の可視化のために準備するAvitin - ビオチン複合体溶液にさらされている。 </li><li>最終的な可視化のステップでは、脳がDABにさらされている。これは危険な製品であり、常に注意して取り扱ってください。ここに見られるように、脳のスライスは、（プロセスを表示する）あなたの目の前で暗い取得し始める。 </li><li> DABの暴露後に、脳は洗浄の最後のシリーズを通過してから、慎重にsubbed顕微鏡スライド上に配置され、（スライド上に脳スライスの配置を示す。subbedスライドのプロトコルのための添付ファイルを参照してください）​​一晩乾燥させる。 </li><li>スライドはその後、最終的に（;プロセスをクリアするための添付ファイルを参照してこのプロセスの様々な側面を見せる）封入し、安全のためslideboxに格納される前にCitrosolvで水没、蒸留水とアルコールの一連の洗浄によってクリアされます。 </li></ol> 4。 Neuroquantification <ol><li>スライドが乾燥した後、彼らは専門のneuroquantificationソフトウェアを使用して評価することができます。ここでBioquantソフトウェアは、マウスの脳の室傍核（画面上のソフトウェア...と顕微鏡を示す）でバソプレッシン陽性細胞と繊維を定量化するために使用されます。 </li><li>興味のある特定の領域は、測定オプションを使用して識別されますneuroquantificationための視野を確立するためのソフトウェア。一貫性のある視野の大きさが（ショーの学生がこれを行う）、各動物のために定量化されていることが重要です。 </li><li>ここで黒く染まったバソプレッシン免疫反応性細胞体と繊維が明らかである。それはこの組織をカウントまたはトレースすることは困難であるため、このソフトウェアの特徴は、興味の指定した領域内に陽性染色組織の総量を決定するために、光スレッシュホールドを使用しています。この閾値はバソプレッシン陽性組織を（コンピュータの画面上にデータ値を表示する）に含まれるどれだけ、指定された領域のを教えてくれる。 </li></ol> 5。行動解析<ol><li>複数の観察者がビデオテープをスコアリングする場合、それは観察者が一貫した方法で動作を獲得していることを保証するために評価者間信頼性を確立することが重要です。実際のスコアリングセッションの場合、行動スコアリングシート（スプレッドシートの得点の例については表2を参照）の観測セッション中の動作の簡単なスコアリングを可能にするために準備する必要があります。 </li><li>高速エピソード応答ではない行動のために、ミクロの分析は、特定の反応の進行についての微妙な違いを明らかにすることができます。例えば、行動をグルーミングすることは非常に速い応答のチェーンで構成されています。ひとつのオプションは、単にグルーミングの存在と持続時間を記録することですが、もう一つはこの応答を伴う一連の出来事を文書化することです。このミクロソフトウェアを使用して、オブザーバーは、ソフト（番組ソフトおよびビデオ）の指示に従って、毎秒特定の行動の存在を得点する。 </li><li>データの収集に続いて、関心のパラメータが決定され、適切な行動スコアが分析されます。例としては、グルーミング、シーケンスの中断（各動物のために入力したデータとスプレッドシートを使用してコンピュータを表示する）の子犬、または番号との接触に費やす時間の合計時間があります。 </li><li>行動が得点されると、それは2つの種が研究への関心の振る舞い​​に対して異なる応答戦略を示したことを確認することが重要です。この場合、カリフォルニア州の鹿のマウスは、一般的なシカのマウスよりも父性行動を示すべきである。さらに、様々な行動措置は、関連する影響のより多くの情報ビューを取得するために、脳の対策と相関することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果： <ol><li>モデルを検証するために、データは明らかに2つの種が関心の動作に関して異なる方法で実行することを示す必要があります。ここでは、そのP.を参照してください。 カブリダニの男性は（図4を参照）、父親の反応の二つの特徴をグルーミングし、子犬を介してしゃがんで多くの時間を過ごした。 </li><li>見られるように、父方のP.;関心のneurobiologial変数は、父方の応答に重要であるバソプレッシンの量（AVP）陽性組織が ​​いくつかの関連する脳の領域のために定量化されているかどうかを判断するために、 カブリダニの動物は、これらの脳領域のいくつかのより多くの免疫陽性細胞を持っていた。 （図5を参照）。 </li><li>ミクロ分析を使用して関連する研究では、それは父方のカリフォルニアのマウスは、その処女の対応よりも不安を示すという仮説された;それに応じて、捕食者の匂いにさらされると、父親は（図を参照してバージンの動物よりも身づくろい順序で中断が少なくて展示6）。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> 図1：子犬同種異星人に向かって父方の応答を示す（A）オスカリフォルニアマウス。子犬同種のエイリアンの存在下で慎重なアプローチ（ストレッチが出席）と回避反応を示す（B）オス鹿のマウス。注：男性が子犬に向かって積極的な反応を示す場合は、これらの社会的相互作用の評価では、実験者はすぐに男性の気をそらすためにケージの上部にヒット。この時点でセッションは終了し、子犬は、削除された傷のために検査し、母親に返されます。当研究室では、このことはほとんどPで観察されない男性のカブリダニが時折Pで観測されるmaniculatus、近くに観察し、即時の介入は、しかし、動物への発生から被害を防ぐ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> 図2：おもちゃのマウスとの対話カリフォルニアのマウスは、ほとんどのこれらの刺激にかむことを試みた。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> 図3：研究の実験設計、各種の各グループで約6匹の動物があった。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> 図4：免疫細胞化学プロセスのグラフィック。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> 図URE 5カリフォルニア州とシカのマウスの父親の応答;より多くの父方の応答は、（新郎、しゃがみ、より速くアプローチ）カリフォルニア州のマウスで観察された。より多くのストレッチ通う（ストレス応答）が鹿のマウスで観察された。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> 図6。両種の様々な脳領域におけるバソプレッシンの免疫反応。カリフォルニアのマウスは、PVNの細胞や繊維のより多くの染色を持っていた。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> 図7：父親のカリフォルニアのマウスは、子犬に暴露し、バージングループよりも捕食者の匂いの存在下で彼らの身づくろいのシーケンスに少ない混乱を示した。

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

（2）正確で高感度免疫細胞のプロトコル、および（3）ほとんどの分析（観測と統計的（1）代表者との有効な動物モデル：この記事では、3つの基本的なコンポーネントは、行動神経科学の調査の実行が成功するために重要であると考えられて説明します）行動と脳データの両方の。単一のカテゴリの間違いが最も確かに全体の研究の成果が損なわれます。したがって、慎重に適切な動物モデルを選択した後、かなりの努力が脳の正常な処理に続いて、動作が確実に試験で観察されることを保証するために行動し、組織学的手順をテストするパイロットの方に指示されるべきである。 前に述べたように、このテクニックは、遺伝子工学や痛みを伴う手術操作を必要としないため、特定の応答の神経生物学的メカニズムを識別するための比較種の使用は、貴重な方法論的アプローチです。従って、この方法論的アプローチは少ない絶滅、インタクトな動物を利用しています。動物の自然なバリエーションの使用は、しかし、動物を実験室に収容されている場合でも、自然に似た環境の取り込みによって強化されている。実験室での研究がさらに関心の挙動に種差の真正性を検証するためにフィールドに拡張することができれば更に、、この次のステップをお勧めします。比較アプローチは多くの利点を提供するが、制限は、データの相関性質であり、したがって、そのような薬理学的操作などの追加のテクニックは、さらに関心の動作で標的神経生物学的システムの役割を検証するために使用する必要があります。 実験者は、行動学的および統計的な手続きについての自信と、ケアは、動物の生活条件は、実験的な操作のため、もちろん、以外のすべてのグループに対して一定に保てるように注意してください。このような実験室での光のスケジュール、ノイズレベル、世話人、湿度や臭いなどの変数の変化は、動物の神経生物学的反応に大きな影響を及ぼす可能性があります。 この記事では一次抗体は、バソプレシンの検出に使用されていましたが、他の一次抗体は、関心の異なる神経化学物質の過多に使用することができます。実験者は、新しい抗体を用いて動作している場合、それは新しい抗体の最適希釈率を決定するために滴定の研究を実施することが重要です。さらに、抗体の過剰な使用は非常に高価であり、多くの時間が多すぎる抗体は、信号を区別するために、暗すぎる組織で、その結果、（のようなベンダーによって提案された）が使用されます。 単一の統計分析よりも、代替ビューとデータの解釈を提供するために使用することができれば最後に、、それらを利用すべきである。この特定の研究では、一般線形モデル、相関、および多次元尺度分析は、データの最も有益なビューを提供するために使用された。

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>双眼複合顕微鏡</td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANTライフサイエンスソフトウェア</td><td> BioQuant画像解析（株） </td><td>バージョン8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflexコンソールドライブやすい負荷L / S（灌流ポンプ） </td><td>コー​​ル - パーマーインスツルメント社</td><td> 7518〜00 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェル細胞培養のクラスター（処理された組織培養、非発熱性ポリスチレン、滅菌） </td><td>コー​​ニングコースター</td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> 25x75x1mm顕微鏡スライド</td><td>グローブサイエンティフィック株式会社</td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1のカバースリップ</td><td>グローブサイエンティフィック株式会社</td><td> 1414年から1410年</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌3MLは大型バルブの転送ピペットを卒業</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70962〜9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconoxの洗剤パウダー</td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S9888 - 1キロ</td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td>一塩基性リン酸ナトリウム</td><td>スペクトラム</td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td>ナトリウムの二塩基性リン酸二水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td>トリトンX </td><td>スペクトラム</td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td>フィッシャー</td><td> SP15 - 500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td>クロム酸カリウム硫酸塩</td><td>シグマ</td><td> C - 5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール、高Den.Polyボトル、200プルーフ、24 × 1パイント</td><td> Pharmco - AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトル</td><td> S - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗バソプレシンの分析物固有の試薬</td><td> Immunostar、（株） </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ウサギIgG（H + L）アフィニティー精製</td><td>ベクトル</td><td> BA - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>エリート標準ベクタステインABCキット</td><td>ベクトル</td><td> PK - 6100 </td><td></td></tr><tr><td> DABペルオキシダーゼ基質キット</td><td>ベクトル</td><td> SK - 4100 </td><td></td></tr><tr><td>オリジナルの味付けされていないゼラチン（4カウント封筒）1オンスボックス</td><td>ノックス</td><td></td><td>地元の食料品店で購入</td></tr><tr><td> 3％過酸化水素</td><td> CareOne </td><td></td><td>地元の薬局で購入</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>クロロックス</td><td></td><td>地元の食料品店で購入</td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

比較種のアプローチは、行動の神経科学者は、特定の動物モデルの特性として表示、特定の動作に関連するさまざまな神経生物学的要因を探索することができます。自然に近縁種との間の動作の違いを発生を生かし、この手法は侵襲的手法は行動の発現を操作する必要はありません。

父親の応答の神経生物学を調査するための比較種のアプローチを使用する

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K ビュー.  Randolph-Macon College. 比較種のアプローチは、行動の神経科学者は、特定の動物モデルの特性として表示、特定の動作に関連するさまざまな神経生物学的要因を探索することができます。自然に近縁種との間の動作の違いを発生を生かし、この手法は侵襲的手法は行動の発現を操作する必要はありません。

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

神経科学

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

ザリガニのリフレクションに行動反応の記録

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

実験経済学と機能的MRI法を用いたリスキーかつ曖昧なオプションの主観的な値を測定する

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

攻撃を研究するための取り扱いがなくなり新たなアプローチと「敗者」の影響で<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

ストライプアッセイは、解離海馬ニューロンを用いたタンパク質基質の魅力や反発作用を検討します

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

小説行動アッセイ個人の味覚応答を調査するために、自由に移動バンブル蜂（<em&gt;セイヨウオオマルハナバチ</em&gt;）

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...