著者らは、資金調達のためにNSF（MCB-1157876）に感謝。我々はまた、彼らのコメントについてアルベルトチヴェッタ、ジョンRoote、二匿名のレフェリーに感謝します。

小規模実験は全体の手順に慣れるために実行する必要があります。 1。処女雌とナイーブ男性の収集概説された実験の最も単純なバージョンは、大人は、次の組み合わせを含む初期の十字架、の4つのタイプで構成されます。）W 1118個人処女雌を収集するためにと、b）オレゴン-Rの個人ナイーブ参照男性を収集するために; C ）P {SW}ホモ接合男性と処女の女性ナイーブ実験男性（タイプI）を収集するために、SDICの野生型の組織を運ぶ制御ラインからのステップと、d）P {SW}ホモ接合男性とSDIC-SW-削除を運ぶSDIC-SW欠乏 （タイプII）を運ぶナイーブ実験男性を収集するために処女雌を。 <ol><li> 8-10女性と5人の男性をそれぞれ含む複数のバイアルを設定します。女性は産むことを許可卵、すべての3〜5日新しいバイアルに大人を転送します。ペットボトルではなく、必要に応じてバイアルを使用し、常に新鮮な食品を使用しています。必要なバイアルの数は、研究中の実験雄タイプの数との違い（ 表1）を検出することが必要であると推定個体数に依存する。バイアルあたり10以上の女性は、子孫の生殖能力の変動を引き起こす可能性が幼虫の成長、中にオーバー混雑になる可能性があります。 25で保存バイアル°温度制御チャンバー内のC。 </li><li>初期の十字架を設定した後の日に11 番目と12 番目の処女雌とナイーブな男性の収集を開始。待機期間は、温度に応じて異なり、低い温度の結果は長く発達時に個人のコレクションを遅らせる。孵化するタイミングに影響を及ぼす他の要因は、媒体の一種である。このようなコーンミール·酵母媒体29として栄養価の高い食品は、大人の適切な開発を保証交配を促進する生殖器系、。嵌合解除の収集は、すべての4-6時間を飛ぶ。収集する場合、バイアルにCO 2を導入することにより、ハエを麻酔、ハエを下にタップし、セックス実体顕微鏡下でそれら（ 図2）。セックスと適切に表現型とラベルバイアルによって異なるバイアルに希望のハエを置きます。 </li></ol> （注1）。コレクションルーチンが破棄によって、午前中に前の夜の間に現れた大人を開始します。日中は一度か二度処女雌とナイーブな男性を収集します。一般的には、D.ショウジョウバエの雄は25℃30℃で羽化後に性的に成熟した8時間になります。ハエは、午前12時12時間の明/暗サイクルの下で維持されている場合は、羽化の二つのピークが予想されています：最初の1〜2時間の間に光をオフにする前に、光が上、そして2時間の間になった後。羽化は蛹暗く後24時間以内に発生します。 （注2）。 10以上の女性SHウルド、過混雑を防止するために同一のバイアルに入れられる。これはまた、それらの少なくとも一つが処女でないので廃棄されなければならない場合には、女性の損失を制限する。 注3。短時間で処女雌と雄ナイーブの適切な数を収集するために、以下の対策を採用することができる。実験的な男性の2つのタイプ（ 表1）を含む実験のために1118ワットの15〜20バイアルを設定します。軽く媒体の表面を振りかけると産卵を促進するために、いくつかの乾燥アクティブ酵母ペレットを追加します。連続した日に親に少なくとも4回を転送します。両親が別のバイアル（ 図3）に転送された後に各バイアルで蛹化のために利用可能な表面を増加させるために、4 回目か5 日目の間にマルチ折り畳まれた紙を（7×5センチ）を挿入します。最初の交配から生まれた、大人の人数が十分でない場合、いくつかのより多くの日を待ち、個人を集める別の日に設定するバイアルからALS。ワークロードを均等にするためにいくつかの連続日間の実験を行うことを計画します。 2。ダブル交配実験 図4は 14で行わダブル交配実験に関わる主な手順を示しています。 <ol><li> 1日目の朝、最初の交配を設定します。オレゴン-Rの男性は犯罪アッセイで交尾する最初のです。 <ol><li>吸引器を使用し、10 4-5日齢の白色目W 1118処女雌と10赤い目オレゴン-Rナイーブ男性それぞれを含むバイアルを設定します。二から三のバイアルを5日間連続して毎日設定されています。セットアップするバイアルの数は、利用可能な個体数に応じて異なる場合があります。ハエが2時間交尾することができます。 </li><li>オレゴン-Rの男性を破棄し、吸引器（ 図5）を使用して、新しいバイアルにそれぞれの女性を配置します。雌雄の判別は、少数の目視検査によって達成することができる形態素差（ 図2）。適切に各バイアルにラベルを付け、2日間（以下 &quot;V1&quot;）用バイアルに女性を残す。 </li></ol></li><li> 3日目に、第二の交尾を設定します。セットアップ男性とクロスの選択は、実験的な男性型のいずれかに向けた潜在的なバイアスを最小化するために、ランダムに行われるべきである。 <ol><li>ライトがオフになっている二時間前に、アスピレーターで新しいバイアルに再びメスを移す。適切に新しいバイアルにラベルを付けます（以下、 &quot;V2&quot;）。 </li><li> V2に同じ遺伝子型の3 5〜6日齢の実験的な男性を紹介します。 </li><li>それぞれの女性のための2.2.1と2.2.2を繰り返します。 </li><li>二時間右4日目、光がオンされる前（ つまり、2.2.1の後には12以上の時間）で、吸引器を使って男性を捨てる。 </li></ol></li><li> 6日目に、別の新しいバイアルに再び各女性を転送します。適切に（以下、 &quot;V3&quot;）新しいバイアルにラベルを付けます。 </li><li> 10日目で、1118ワットを破棄</&gt;雌（商標）。 </li><li> v2とv3では子孫を調べます。女性はV2の女性最初に起動した産卵後17日目に例えば V2（またはv3）に導入された後の最初の検査は13-15日後に行われます。第2の検査は17日後に正確に実行されます。この時間枠は、同じバイアルには第二世代であることが保証され、安全な上限時間的な境界をもたらす。子孫カウントを促進しつつ二検査が過剰混雑を防ぐ。 <ol><li> 17日目で、V1を検査し、現在の赤い目の子孫が存在することを確認してください。それに応じてバイアルをマークされていない場合。白目子孫の存在はない子孫が参照または実験的な男性とその交配が発生しなかったことを示していないながら、女性が最初の交配時に処女ではなかったことを示しています。 </li><li> 17日目で、V2の最初の検査を行う。麻酔は、CO 2とV2に子孫が登場し、目の色や性別によって、それらを並べ替える。最初と秒で父親レコード子孫番号ONDの男性。 図6は、各交配スキームの子孫で予想される表現型を示しています。この特定の実験14では、基準又は実験によって産ま雄雌の子孫としてのみを明確に割り当てることができるので、唯一の娘からの情報は、P 2を計算するために使用することができる。他のマーカーとの男性の子孫の父親が明確に割り当てることができる場合は、雌雄の子孫の数は下流の計算に用いることができる。子孫を捨てますが、第2の検査のためにv2を保つ。 </li><li> 20日目に、V2で新たに浮上して子孫と2.5.2のように進み、その後、バイアルを捨てる。 </li><li> 20日目に、初めてv3では現れ子孫を検査し、ステップ2.5.2に従ってください。 </li><li> 23日目では、v3では新たに浮上して子孫と2.5.3のように進んでください。 </li></ol></li></ol>注1：複数の交配が持つかもしれないことをPのスコアに対する潜在膨張効果（2.2.2および2.2.3）のため、交配特定の時間枠に限定することができる。時間枠は使わ女性と男性の遺伝子型に関連付けられているremating周波数に依存します。複数交配の確率は特別に夜の時間11時に削減されます。 注2：大人のハエの数が低いときに、これは酵母の潜在的な異常増殖が原因で問題を引き起こす可能性があるため、生酵母ペレットを追加しないでください。 3。データ解析<ol><li>録画子孫カウントは、適切な統計パッケージ（SASインスティテュートから例えば JMP）または無料のWebベースのツール（ 例で簡単に目視で効率的な分析のために適切に組織されるべき<a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ）。 </li><li>精子競争能力。 v2とv3のからカウントを追加します。ないか非常に限られた子孫（ 例えば &lt;10）に上昇を与えている女性のハエは、手順の間に死亡した、または唯一の成功しinseminaあっ2人の男性の一人テッドは、非有益とみなされており、任意の下流の統計分析（2.5.1及び表2）から除外されます。各有益な女性のためのP 2得点を計算します。 </li><li>比べ実験男性の間でP 2値の統計的に有意な差があるかどうかをテストします。これはパラメトリック（ 例えば TukeyのHSD）またはP 2値の分布の歪度と分散と平均の間の依存関係など、いくつかの要因に依存してノンパラメトリック（ 例えばスチールDwass）テストを使用して行うことができます。角度変換は、一般にパラメトリック検定31の使用に先立って、例えばP 2などの割合に適用される。 </li><li>合率の違い（オプション）。各実験オスタイプの場合、二重に交配した雌と、最初の男性（犯罪アッセイにおける参照オスとDの実験の雄と交配するものの数を計算efenseアッセイ）。両側フィッシャーの正確確率検定を（で入手使用<a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ）、実験的な男性の2つのタイプの間に統計的に有意な差があるかどうかを判断する。 </li><li>性比（オプション）。各実験の男性の場合は、予想される1:1の比率から、各女性の外れから子孫の性比かどうかを判断するためにカイ二乗検定を使用しています。 </li></ol>

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利害の衝突は宣言されていない。

我々は、遺伝的に異なるの相対的な寄与の違いを評価するために実験的な設計を記載しているD.対照二重交配実験7,8で子孫にショウジョウバエのオス。これは、精子競争能力に影響を与えると仮定遺伝因子のコンテキスト内で行われたと同様の手順では、防御アッセイ（ 図1）に適用されるが、それはオフェンスアッセイ内に例示されている。この実験計画?...

ジェフ·パーカーが、昆虫やその進化の意味2の精子競争の有病率を指摘しているので、 ショウジョウバエや他の種における研究の急増は、多くの異なるレベルでこのような現象にいくつかの光を当てることを試みた。関心のある分野のいくつかの例は、自然個体9,10、その遺伝アーキテクチャと遺伝的要因11-14、そして男女15,16の間に共進化を駆動におけるその役割の基礎との関連性で、その変化の調査であった。 D.でショウジョウバエの雌、専門の精子貯蔵器官の限られた容量、貯精嚢と精レセプタクル6,17のペアは、別の男性からの精子の競争に貢献しています。約1,500精子が挙げ臓器18,19に収容することができます女性だけ〜500に交尾中に転送されます。研究室では、管理されたダブル交配実験基準男性および1つまたは複数の目的の雄を含むメンツが広く精子競争力7,8を評価するために使用されてきた。 精子競争能力は合計子孫上、 すなわちその実験と参照男性の両方からダブル交配実験で実験男性によって産ま子孫の割合と推定される。精子競争能力は、2つのコンポーネント、別個のアッセイで評価し、それらの各々を含む。オフェンスアッセイ、第雄から精子を置換するための実験的な男性の精子の能力では、基準マレ、 すなわち評価される。逆に、防御アッセイにおいて、変位に抵抗するか、または基準男性の精子の受精の成功を低減するために実験的な男性の精子の能力が評価される。アッセイ、防御または攻撃の種類に応じて、精子競争力がゴールP 1又はP 2のそれぞれを介して推定される。 P1、P 2は、0と1の間の値だけを取ることができる。中間値は、通常は直接精子競争を伴う生理的なシナリオを示唆している精子混合、の間接的な証拠として解釈されます。同じ根拠に続いて、極端な値が強力な差動精子競争能力の証拠として解釈することができます。初期の研究では、ことを示したDのP 2 ショウジョウバエは 7が長く2交配間の経過時間として増加0.8を超えています。この同じ実験計画は、他のショウジョウバエ種で使用されている、P 2は、精子競争力20を評価する試験において一般的に使用される統計量である。ほとんどの種について、試験した菌株のP 2の値が0.6以上である21。それにもかかわらず、別の男性の精子との間の直接的な競争とは無関係な他のいくつかのメカニズムが同じスコアを（説明を参照）を得ることができます。 D第一又は第二の男性が産まistinguishing子孫を容易に識別マーカーの使用を介して可能である。初期の研究では、男性のいずれかの致死線量で照射した、例えば、照射された精子によって受精したX線ように実質的にすべての卵子では7孵化に失敗しました。続いて、眼の色素沈着または翼の形状を変化させる変異は、最も一般的に使用されるマーカーされている。前者の例としては、突然変異であるBW（ブラウン）9、CN（辰砂 ）22とW（白 ）23、表現型の二種類に変異サイ （ カーリー ）24 ​​に対応しながら、これらの変異のいくつかはに統合されました同じ個人、 例えばCN体重 。公知の遺伝パターンと少ない程度、アロザイム25及びマイクロサテライト26,27にも使用されている。 の違いをテストするための実験デザインここで説明する精子競争力は本質的にクラークらのことを次の9。これらの実験から得られた結果は、精査の下で実験的な男性のタイプの差父親に関する情報のみを与える。受精後のフィットネス14,28の違いと精子可視化技術24は P 1の違い（またはP 2）スコアが精子能力の違いとして解釈されることを可能にするためにも金を作るアッセイ。 図1は攻防アッセイの両方の原理を概説します。プロセスの物流を説明するために、攻撃実験をD.で行うキイロ 14について詳細に説明する。この特定の犯罪アッセイは精子競争力上の多重遺伝子ファミリー精子特有のダイニン中間鎖（SDIC）の測定可能な効果をテストするために使用されていました。すべてのメンバーこの多重遺伝子ファミリーのsがX染色体上にタンデムに存在します。ノックアウト男性はSDICクラスタを削除することによって生成された。削除されたセグメントはまた必須遺伝子短い翼（SW）が含まれており、研究の目的は、SDICの関連性を評価することであったので、SDIC-SWの削除を運ぶ男性は（P {SW}として象徴SWのトランスジェニックコピーによって救出されたまた、染色体2上のミニ白レポーター遺伝子）を実施している。眼の色は父親を識別するための可視マーカーとして使用した。すべてのハエは参照男性として用いた菌株オレゴン-Rからのものを除いて、 白の変異背景にあった。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

卵子が受精するための同種オス間の競争は、生き残りと生存1の最大化に成功した交配イベントの数を最大化するのではなく、上で動作性選択、 つまり選択のメカニズムの1つです。精子競争が彼らの精子は、時間と空間の偶然であるのと同じ女性2で交尾後のオス間の競争を表しています。この現象は、植物や動物3の複数の種が報告されている。例えば、野生で捕獲されたD.ショウジョウバエのメスは通常2-3人の男性4から精子が含まれています。精子は、異なる男性2,5から精子の直接競争につながる可能性が限られたストレージ容量を持つ専門の臓器に格納されています。 関心の異なる男性（実験オスタイプ）の精子競争力を比較すると対照二重交配experimenを介して実行されています実験6,7のTS。簡単に説明すると、単一の女性を連続二つの異なる男性、1実験雄と1クロス交配リファレンス男性にさらされている。同じ交配スキームは、その後こうして共通の基準を通じて精子の競争力の間接的な比較を容易にし、他の実験的な男性のタイプを使用して続いている。実験および参照男性が父親の個人の割合は、一つは単純な数式の7,8を使用して精子競争能力を推定することができるマーカーを使用して識別されます。また、精子競争力を実験オス異なる能力属性の反射であると仮定されメイト（それぞれ攻撃と防御アッセイ）09への第2又は第であるかに応じて2つの異なるシナリオで推定することができる。 ここでは、推定さtの根底に異なる遺伝因子の役割を調べるために役立ちアプローチを説明彼D.の精子競争力の現象キイロ 。

表2は、Dに（アッセイ1及び2）2犯罪の実験のいくつかの顕著な特徴をまとめたもの機能SDICクラスタとと（タイプIおよびII、それぞれ）なしのショウジョウバエの実験男性は14を比較されます。いくつかの基準にレプリケートで発生する異なる発生率を取った後、雌の58から83パーセントは、有益であることが判明したため、その子孫の父親カウントがP ...

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

間の差分精子競争力<em&gt;ショウジョウバエ</em異なる遺伝子型を持つ&gt;男性はダブル交配実験により確認することができる。これらの実験の各々は、金利および参照男性の男性のいずれかを含んでいる。子孫で容易に識別マーカーはそれぞれ男性で父親個人の画分の推論を可能にする。

の精子競技能力の違いを評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K ビュー.  University of California, Irvine. 間の差分精子競争力ショウジョウバエ男性はダブル交配実験により確認することができる。これらの実験の各々は、金利および参照男性の男性のいずれかを含んでいる。子孫で容易に識別マーカーはそれぞれ男性で父親個人の画分の推論を可能にする。

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

生物学

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ショウジョウバエの蛹の解剖学的、固定、視覚化

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...