我々は、この原稿の重大な編集にはこの作業の寛大な支援と監督のロバートA.ワインバーグ（ホワイトヘッドバイオ医療研究所、ケンブリッジ）と氏キーランMellody（マンチェスター大学、マンチェスターの）感謝。このプロジェクトは、研究英国（CR -英国）承認番号C147/A6058（AO）によってサポートされていました

1。初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞の分離初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞を単離するための実験手順を図で説明されています。 1A。 <ol><li>以前に12を説明するように、細胞解離バッファーを準備します：10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン-ストレプトマイシン（200単位/ ml）、コラゲナーゼタイプI（1 mg / ml）を、ヒアルロニダーゼ（とダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を125単位/ ml）。 </li><li>削減乳房形成（〜0.5グラム）、リン酸の数倍は緩衝生理食塩水（PBS）から解剖乳房組織を洗浄する。無菌かみそりの刃を使用して小さな断片（&lt;1.5 mm 3の ）に組織をミンチ。 </li><li>上記の細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスの適切な量を含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。 </li><li>細胞解離バッファーfの組織断片を消化または12月18日37時間℃でゆっくりと撹拌しながら。依然としてチューブに残っている未消化の組織片の多くの部分があることに*注意。 </li><li>撹拌せずに室温で5分間チューブをインキュベートします。 5ミリリットル血清学的ピペットを使用して、新しいコニカルチューブに生じる間質細胞の濃縮上清を移す。 </li><li> 250 × gで5分間、間質フラクションを遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間、再び遠心し10％FCSを含むDMEMで細胞ペレットを再懸濁します。文化37 15センチメートルペトリ皿に10％FCSを含むDMEMで細胞は℃、5％の二酸化炭素。 </li><li>コンフルエントになるまで細胞を伝播する。それは通常8-10日かかります。 -80細胞を° Cで保存凍結培地（10％ジメチルスルホキシドおよびDMEMに20％FCS）を使用。オリジナルの株式を5凍結バイアルを準備。 1バイアルを解凍し、5個体群内で継代線維芽細胞を含む二次株式を5バイアルを準備するために細胞を拡大するその後の実験のための倍加（PD）に。これらの手順は、拡張された組織培養中に発生することができるクローン選択と文化のストレスを最小限に抑える。P1.1 - 7はまた、乳房切除術12で得られた乳癌からCAFSを切り離すために使用されることができるのでご注意ください。 </li></ol> 2。 GFP標識、ピューロマイシン耐性、不死化したヒト正常乳腺線維芽細胞の世代<ol><li> P1.7で単離された初代ヒト正常乳腺線維芽細胞）をimmortaliseに、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトル12を 、ご紹介。 4-5日の培養細胞をしてから、GFP陽性細胞をフローサイトメトリーを用いてソートする。 </li><li> GFPで標識された不死化線維芽細胞にピューロマイシン耐性遺伝子をコードする構築レトロウイルスpBabe -プーロをご紹介。文化ピューロマイシンの存在下で5〜7日間（最終濃度：1μg/ mlの）のための細胞がGFP陽性（GFP +）、ピューロマイシン耐性（プーロRを分離する</sup&gt;）がヒト乳腺線維芽細胞を不死化。 </li><li>次に、これらの線維芽細胞は、GFPとピューロマイシン耐性をコードする遺伝子の水平伝達につながることができるアクティブなウイルスを作り出すかどうかを調べるために、2日間6センチメートルシャーレ内2.5x10 5 GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞を成長させる。 </li><li>フィルタメディアは、シリンジフィルター（孔径：0.45μm）を使用して、これらの線維芽細胞によって調整し、ウイルス感染の効率を高めるプロタミン硫酸塩の存在下で12時間のための10T1 / 2マウス繊維芽細胞（5μg/ ml）を上に追加します。培地は、その後さらに2日間、10％FCS - DMEMに変更されます。 </li><li>蛍光顕微鏡で細胞を調べます。 GFPウイルスに感染10T1 / 2細胞ではGFP陽性になります。 5-7日間ピューロマイシン（1μg/ ml）を持つ細胞も扱い、あらゆるプーロR 10T1 / 2細胞はピューロマイシンの治療後に存在し、フォームコロニーであればプレートを観察。 </li><li>なお、水平遺伝子トランジスタ親のGFP +プーロRヒト乳腺線維芽細胞によって産生さアクティブなウイルスによってsferは、腫瘍の異種移植片内の周囲のマウス細胞および/ ​​または癌細胞GFP +プーロRを行うことがあります。これは、腫瘍の異種移植片から最初に注入されたGFP +プーロRヒト乳腺線維芽細胞を単離するプロセスの妨げになる場合があります。 </li></ol> 3A。免疫不全マウスに乳癌細胞とヒト乳腺線維芽細胞の共射出 EXP - CAFSを生成するための実験手順を図に示します。 1BA。 <ol><li>ミックス1 × 10 6 MCF - 7 - rasのヒト乳癌細胞と3 × 6 GFP +プーロR、P2.2で生成された不死化ヒト乳腺線維芽細胞）。 50％（v / v）の注入あたりの​​マトリゲルで培養液400μlの細胞を準備します。 </li><li>免疫不全ヌードマウスに皮下細胞の混合物を注入する。 CAFSは異なるから独立して抽出されている場合腫瘍は、いくつかのマウスの右と左脇腹に各混合物を移植。 </li></ol> 3B。免疫不全マウスにヒト乳腺線維芽細胞の注入<ol><li> EXP - CAFSに対する制御の線維芽細胞を生成するには、50％（v / v）のマトリゲルあたりの注入（図1BB）で培養液400μlにP2.2に生成された3 × 10 6 GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞を準備します。癌細胞と線維芽細胞を混合しないでください。 </li><li>ヌードマウスの皮下部位にP3b.1で準備した線維芽細胞を移植する。 </li></ol> *接種線維芽細胞が皮膚の下に線維芽組織ではなく、腫瘍を形成することに注意してください。 4A。腫瘍の異種移植片の解剖<ol><li>皮下ヒト乳癌異種移植を保有するマウスの42日後移植（図1BAを）Euthanise。際に他の癌細胞および/ ​​または線維芽細胞がcoimplantedされていること*注、線維芽細胞は、それらの筋線維芽細胞表現型を開始するために腫瘍の異種移植片内でより長い42日間インキュベートする必要があります。 </li><li>鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスの横腹から腫瘍の異種移植片を採取する。 PBSで腫瘍組織を浸す。 </li></ol> 4B。線維芽細胞の異種移植片の解剖<ol><li>線維芽細胞の異種移植42日後移植（図1BB）を抱いてマウスをEuthanise。 </li><li>鉗子やハサミを使用して皮下線維芽細胞の異種移植片を解剖。 PBSに線維芽組織を置く。小さな透明な組織として表示される線維芽細胞の異種移植は、皮膚の下を探すのは難しい場合がありますのでご注意ください。 </li></ol> 5。異種移植片からの初代培養細胞の調製<ol><li>腫瘍（〜0.5グラム）または線維芽組織（〜0.1グラム）を解剖するために無菌生物学的安全キャビネットを使用してください。 15cmの文化Dの最上位に摘出した組織を転送する1mlのPBSでっぽい。無菌かみそりの刃を使用して小さな組織片（&lt;1.5 mm 3の ）に組織をミンチ。 *線維芽細胞の異種移植片は、以下の0.1グラムの重さなら、いくつかの追加の線維芽細胞の異種移植片を収集し、単離のためのセルの数を増やすために、それらを一緒に混ぜることに注意してください。 </li><li>細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスを含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。 </li><li> 37℃で3時間細胞懸濁液をインキュベート°、連続、低速撹拌しながらC。 </li></ol> 6。培養中のピューロマイシン耐性細胞の分離<ol><li> 250 × gで5分のための腫瘍または線維芽細胞異種移植片のいずれかから解離細胞懸濁液を遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間遠心する10％FCS - DMEMで得られた細胞ペレットを再懸濁します。 37ピューロマイシン存在下（1μg/ mlの）で15センチメートルペトリ皿° Cで培養細胞をあらゆる汚染癌細胞および/またはマウス間質細胞を除去するために、5％の二酸化炭素。コンフルエント（2-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。 *注その結果プーロR細胞 、指定された42日齢のEXP - CAF1（図1BA）またはコントロール線維芽- 1細胞（図1BB）、不滅とGFPの陽性である。それは、P2.3 - 6で説明したように、これらの細胞は、10T1 / 2細胞を使用して、アクティブなウイルスを作り出すかどうかを確認することをお勧めします。 </li></ol> 7A。文化におけるEXP - CaF2薄膜の細胞の単離さらにCAFSの活性化筋線維芽細胞表現型を増強するため、42日齢のEXP - CAF1 MCF - 7 - rasの細胞と細胞を混合し、200日の追加期間のヌードマウスに皮下再度注入する。細かく分析し、ピューロマイシン（1μg/ mlの）の存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿の中で単一細胞懸濁液と培養細胞への腫瘍の異種移植片を解離させ、ようにP6に示す0.1。コンフルエント（8-10日）まで、細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロR細胞は 242日齢のEXP -フッ化カルシウムの細胞（図1BA）という名前が付けられます。 図7b。文化のコントロール線維芽- 2細胞の抽出 EXP - CaF2薄膜細胞に対する制御の線維芽細胞を生成するには、200日間、さらにヌードマウスに皮下癌細胞なしで単独で42日齢のコントロール線維芽- 1細胞​​を注入する。としてP6.1で示されたピューロマイシンの存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿中の細胞を（1μg/ ml）を摘出し、単一の細胞懸濁液と文化に線維芽組織を解離する。コンフルエント（3-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロR細胞はコントロール線維芽細胞- 2細胞（図1BB）という名前が付けられます。 8。代表的な結果： コントロール線維芽細胞- 2、EXP - CaF2薄膜セル乳房の腫瘍の異種移植片から抽出されているlsは、、人間を示す、人間特有のビメンチン、プロリル-4 -ヒドロキシラーゼ、コラーゲン1A、フィブロネクチン、S100A4、および線維芽細胞の表面タンパク質（図2A）11を含む間葉系マーカー、のために強く陽性に染色起源とこれらの細胞の間葉系の性質。対照的に、サイトケラチン、上皮細胞のマーカーは、これらのGFP +繊維芽細胞（図2B）で染色されなかった。これらの知見は、したがって、抽出されたEXP - CaF2薄膜および制御線維芽- 2細胞は、最初にマウスの異種移植片に導入された親のヒト乳腺線維芽細胞から発信されていることを示唆している。 重要なのは、EXP - CaF2薄膜の細胞の割合が高く、α- SMAと42日齢のEXP - CAF1とコントロール線維芽- 2細胞（図に比べて筋線維芽細胞のマーカーが、どちらも細胞外マトリックス糖タンパク質テネイシン- C 5、のために陽性に染色。2C、D）11。これらのデータは、その居住者、人間の乳腺fibrを示しているoblastsは徐々に腫瘍異種移植片内でCAFの筋線維芽細胞へと進化。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> ヒト乳腺線維芽細胞の分離の図1の模式図。 A）削減乳房形成組織は無菌かみそりの刃（P1.2）を使用してミンチと15 mlコニカルチューブ（P1.3）に移した。小さ ​​な組織片を細胞解離バッファー（P1.4）で消化し ​​、in vitro（P1.5 - 7） で培養のために調製した。 、隔離された一次ヒト乳腺線維芽細胞、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトルを、immortaliseには導入され、その結果、GFP陽性細胞はフローサイトメトリー（P2.1）を用いて選別した。ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウイルスpBabe -プーロのベクトルは、これらの細胞に導入した。ピューロマイシンの治療時に、GFP -標識（GFP +）ピューロマイシン耐性（ピューロR）、immortalisedのヒト乳腺線維芽細胞は、（P2.2）を単離した。 BAは）EXP - CAFSを生成するには、GFP +プーロRはヒト乳腺線維芽細胞を免疫不全ヌードマウス（P3A）の皮下にMCF - 7 - rasの乳癌細胞でcoinjectedされた不死化。腫瘍の異種移植は、移植後42日（P4A）で切除し、単一細胞懸濁液（P5）に解離した。これらの細胞は、任意の混入癌細胞とマウス間質細胞（P6）を排除するためにピューロマイシンの存在下でin vitroで培養した。結果としてピューロマイシン耐性細胞は、実験的に生成されたCAF1（EXP - CAF1）細胞と呼ばれた。これらの細胞は、切除42日移植後は、再びMCF - 7 - rasの細胞と混合し、（P7a）前と同じように、ホストマウスに皮下移植した。結果腫瘍は200日の追加期間増殖させ、その後解剖、解離、およびピューロマイシンの存在下で培養した。孤立ピューロマイシン耐性細胞は、EXP -フッ化カルシウムの細胞（242日齢）と呼ばれた。 EXP - CAFSに対するコントロール細胞を単離するためにはBB）は 、GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞は、MCF - 7 - rasの細胞（P3B）なしで純粋培養としてヌードマウスに皮下注射した。解剖線維芽組織は、42日後移植（P4Bは）、、コントロール線維芽細胞- 1細胞​​という名前の単細胞懸濁液（P5）およびピューロマイシン耐性細胞に解離前述のように（P6）を単離した。これらの線維芽細胞は、再び200日（P7B）のためにさらにMCF - 7 - rasの細胞なしでヌードマウスに皮下移植した。線維芽組織の解離、解剖、およびピューロマイシンの存在下で培養した。分離されたピューロマイシン耐性細胞は、コントロールの線維芽細胞- 2細胞を（242日齢）と呼ばれた。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> 図2 <st栄は、&gt; EXP - CAFSと制御の線維芽細胞は、親のヒト乳腺線維芽細胞に由来する。 （A）コントロール線維芽細胞- 2（コントロールF.）とexp - CaF2薄膜の細胞の免疫蛍光分析。両方の細胞型は、人間のビメンチン、プロリル-4 -ヒドロキシラーゼ、コラーゲン1A、フィブロネクチン、S100A4、および線維芽細胞の表面蛋白質を含む間葉系マーカー（赤）、陽性の染色。（B）とは対照的に、汎サイトケラチン、上皮細胞のマーカー、GFP（緑）を発現するEXP - CaF2薄膜細胞では検出されていません。細胞核は、4&#39; - 6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（青）で染色されています。スケールバーは50μm（小島らから呼ばれる。11） （C）EXP - CaF2薄膜の細胞とα- SMA（赤）またはテネイシンC（TN - C）（赤）に対する抗体を使用してコントロール線維芽- 2細胞（コントロールF.）の免疫蛍光。細胞核はDAPI（青）で染色されています。スケールバーは50μm。EXP - CaF2薄膜セルの（D）48％は1、一方、α- SMA陽性の染色42日齢のEXP - CAF1の4％、対照線維芽細胞- 2細胞集団の2.5％がα- SMAが陽性です。 （小島ら11から参照される）

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利害の衝突は宣言されません。

CAF -特異的マーカーとCAFSの間で観察された不均質性のレベルの欠如は、この細胞型自体の課題の特性評価をレンダリングする。 in vitroで研究するCAFSはまた、これらの細胞が老化し、長期間培養すると増殖が停止する追加の合併症によって妨げられている。直接レトロウイルステロメラーゼcDNA構築物を使用して、プライマリCAFSをimmortaliseに私たちの以前の試みは失敗しました。したが?...

<table border="1"><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td></td><td>シグマ</td><td> C0130 - 1G </td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td></td><td>シグマ</td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン（V9）抗体</td><td></td><td> Novocastra研究所</td><td> NCL - L - VIM - V9 </td><td></td></tr><tr><td>テネイシンC（BC - 8）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td>からの贈り物 博士<stroNG&gt;ルチアーノ Zardi </td></tr><tr><td> α- SMA - Cy3の（1A4）抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td>プロリル-4 - ヒドロキシラーゼ</td><td></td><td> Dako社製</td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> （5B5）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンタイプ1の1A抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td>汎サイトケラチン抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td></td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1（線維芽細胞特定のタンパク質- 1）抗体</td><td></td><td> Dako社製</td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞表面タンパク質 （クローン1B10）抗体</td><td></td><td>アブカム</td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> MSCV - IRES - GFPコンストラクト</td><td></td><td></td><td></td><td>作家へのお願い</td></tr><tr><td> pBabe -プーロ構造</td><td></td><td></td><td></td><td>購入 Addgeneから</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td></td><td>シグマ</td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td>シグマ</td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td></td><td>コー​​ニング</td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td>ヌードマウス</td><td></td><td>タコ</td><td> NCRNU - F </td><td>女性のNCRヌード</td></tr><tr><td> C3H/10T1/2細胞</td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL - 226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

癌は、腫瘍細胞と&quot;質&quot;と呼ばれる非癌コンパートメントで構成される複雑な組織です。間質は、細胞外マトリックス（ECM）と1-3線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞と白血球を含む間葉系細胞が、様々な構成されています。 腫瘍関連間質には、近隣の癌細胞から放出される実質的なパラクリン信号に応答する。病気のプロセスの間、間質は、しばしば筋線維芽細胞の多数を含む、癌関連線維芽細胞（CAFS）によって人口になります。これらの細胞は、以前はそれらのin vitroでの培養のためのヒト癌の多くの異なる種類から抽出されています。 CAFSの亜集団は、4,5、そのα-平滑筋アクチンのアップレギュレーション（α- SMA）の発現を介して識別可能である。これらの細胞は、筋線維芽細胞Cと同様の性質を共有する&quot;活性化線維芽細胞&quot;の特徴です。ommonly負傷したと線維性組織6で観察された。この筋線維芽CAFのサブセットの存在は非常に高品位な悪性腫瘍に関連し、患者の予後不良に関連付けられています。 私たち自身を含む多くの研究室では、、CAFS、免疫不全マウスに癌細胞を注入、大幅に腫瘍形成7-10を促進することができることが示されている。癌患者から調製CAFSは、しかし、頻繁に継続的な実験を通してそれらの使用の広範さを制限する文化の伝播中に老化を受ける。この困難を克服するために、我々はcoimplantationの乳房の腫瘍の異種移植モデルを用いて、実験的にヒト乳腺線維芽細胞から不死化したヒト乳腺CAF細胞株を（EXP - CAFS）を生成するための新しい技術を開発。 EXP - CAFSを生成するためには、リダクションの乳房形成組織から得られた親のヒト乳腺線維芽細胞は、最初immortaliいたテロメラーゼ、テロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット、およびGFPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子に設計さとSED。これらの細胞は、マウス異種移植に活性化rasがん遺伝子（MCF - 7 - rasの細胞）を発現するMCF - 7ヒト乳癌細胞でcoimplantedていた。 in vivoでのインキュベーション期間の後、最初に注入されたヒト乳腺線維芽細胞は、それらのピューロマイシン耐性11に基づいて腫瘍の異種移植片から抽出された。 我々は、筋線維芽細胞表現型を採用し、常駐ヒト乳腺線維芽細胞が分化したことを観察し、腫瘍の進行の過程で腫瘍促進特性を取得した。重要なことは、これらの細胞は、EXP - CAFSとして定義されて、密接に患者から切除した乳癌から分離されたCAFSの腫瘍促進筋線維芽細胞表現型を模倣する。私たちの腫瘍異種移植片由来のEXP - CAFSしたがって人間breasでCAFSの生物学を研究するために効果的なモデルを提供tの癌。記述されたプロトコルはまた、ヒト癌の他の型から派生した様々なCAFの集団を生成し、特徴付けるために延長することができる。

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K ビュー.  University of Manchester. 腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。

ビデオ: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

医学

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

人間の内胸動脈（IMA）移植およびステント留置術：ステント内再狭窄の開発を研究するための人体モデル

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

プライマリーヒト線維芽細胞の導出のために皮膚パンチ生検植文化

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...