우리는이 작품이 원고의 중요한 편집을 위해 씨 Kieran Mellody (맨체스터 대학, 맨체스터)의 관대한 지원과 감독에 대한 박사 로버트 A. 와인버그 (바이오 메디컬 연구, 케임 브리지에 대한 화이트 헤드 연구소)을 주셔서 감사합니다. 이 프로젝트는 연구 영국 (CR - 영국) 부여 번호 C147/A6058 (AO)에 의해 지원되었다

1. 기본 교양 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포의 분리 기본 교양 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포를 분리를위한 실험 절차는 그림에 설명되어 있습니다. 1A. <ol><li> 10% 소태아 혈청 (FCS), 페니실린 - 스트렙토 마이신 (200 단위 / ML), collagenase 유형 I (1 MG / ML)와 hyaluronidase (와 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM)로 이전 12 설명되어있는 세포 분리 버퍼를 준비 125 단위 / ML). </li><li> 감소 mammoplasty (~ 0.5 g) 인산에 몇 시간은 식염수 (PBS)를 버퍼에서 해부하는 유방 조직을 씻으십시오. 멸균 면도날을 사용하여 작은 조각 (&lt;1.5 mm 3)로 조직을 말하다. </li><li> 위의 세포 분리 버퍼 (조직 0.5 g 당 10 ML)와 최대 속도에서 1 분 와동의 적절한 금액을 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 조직 조각을 전송합니다. </li><li> 세포 분리 버퍼 F의 조직 조각을 다이제스트또는 12-18 37 H ° C 느린 동요와 함께. 아직도 튜브에 남아 소화되지 않은 조직 조각의 여러 가지가있을 것입니다 * 참고. </li><li> 교반하지 않고 상온에서 5 분 튜브를 품어. 5 ML serological pipet을 사용하여 새 원뿔 튜브로 인한 stromal 세포 강화 뜨는을 전송합니다. </li><li> 250 X g에서 5 분 stromal 분수를 원심하여 PBS로 세포 펠렛을 resuspend. 250 X g에서 5 분 다시 원심 분리기와 10 % FCS와 보충 DMEM으로 세포 펠렛을 resuspend. 문화 DMEM, 37 ° C와 5 % 이산화탄소에서 15cm 페트리 접시에서 10 % FCS를 포함에있는 세포. </li><li> 합류 때까지 전지를 전파. 그것은 일반적으로 8~10일 소요됩니다. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체 (10 % 디메틸 sulfoxide와 DMEM에 최고 20 % FCS)를 사용. 원래 주식으로 5 냉동 튜브를 준비합니다. 한 병을 녹여 및 섬유아 세포를 포함하는 보조 주식 5 튜브를 준비하는 세포를 확장 5 인구 이내 passaged후속 실험에 대한 doublings (대조해). 이러한 절차는 확장된 조직 문화 중 발생할 수 clonal 선택 및 문화 스트레스를 최소화합니다. P1.1 - 7은 또한 유방 절제술 12 얻은 유방 carcinomas에서 CAFs를 격리에 사용될 수 * 있습니다. </li></ol> 2. GFP - 라벨, puromycin 모성, 불후의 인간 섬유아 세포의 정상적인 mammary 생성 <ol><li> P1.7에 격리된 기본 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포)를 immortalise하려면 hTERT와 GFP를 모두 표현하는 retroviral pMIG (MSCV - IRES - GFP) 벡터 12, 소개합니다. 다음 문화 4~5일에 대한 세포 및 GFP - 긍정적인 유동세포계측법를 사용하여 세포를 정렬합니다. </li><li> GFP - 라벨 불후의 섬유아 세포에 puromycin 저항 유전자를 인코딩 구축 retroviral pBabe - puro을 소개합니다. 문화 puromycin의 존재에 5-7일 (최종 농도 1 μg / ML)의 세포가 GFP 양성 (GFP +), puromycin 모성 (puro R를 분리 </suP&gt;) 인간 mammary 섬유아 세포를 영원히. </li><li> 다음,이 섬유아 세포가 GFP 및 puromycin 저항을 인코딩 유전자의 수평 이동으로 이어질 성장할 수 활성화된 바이러스, 2.5x10 5 GFP + puro R 2 일간 6cm 배양 접시에있는 인간 mammary 섬유아 세포를 영원히. 생산 여부를 검토 </li><li> 필터 매체는 주사기 필터 (구멍 크기 : 0.45 μm의)를 사용하여 이러한 섬유아 세포에 의해 시설과 바이러스 감염의 효율성을 증가 프로타민 황산 (5 μg / ML)의 면전에서 12h에 대한 10T1 / 2 마우스 fibroblastic 세포에 그것을 추가합니다. 매체는 다음 추가 이일 10 % FCS - DMEM으로 변경됩니다. </li><li> 형광 현미경으로 세포를 검사합니다. GFP 바이러스에 감염된 10T1 / 2 세포가 GFP 양성하게 될 것입니다. 5~7일에 대한 puromycin (1 μg / ML) 또한 세포를 치료하고 puro R 10T1 / 2 세포 puromycin 치료 후 현재와 양식을 식민지하는 경우 번호판을 관찰합니다. </li><li> 참고 수평 유전자 트란부모 GFP + puro R 인간 mammary 섬유아 세포에 의해 만들어진 활성 바이러스 sfer는 종양의 xenografts 내에서 주변 murine 세포 및 / 또는 암종 세포 GFP + puro R을 수 있습니다. 이것은 처음 주입 GFP 종양의 xenografts에서 + puro R 인간 mammary 섬유아 세포를 분리의 과정을 방해 수 있습니다. </li></ol> 3A. immunodeficient 마우스로 유방 암종 세포와 인간 섬유아 세포의 mammary Coinjection EXP - CAFs을 생성하기위한 실험 절차가 그림 그림입니다. 1Ba. <ol><li> 믹스 1x10 6 MCF - 7 - RAS 인간의 유방 암종 세포 및 3x10 6 GFP + puro R, P2.2에서 생성된 불후의 인간 mammary 섬유아 세포). 50 % (V / V) 사출 당 Matrigel와 문화 매체 400 μl의 세포를 준비합니다. </li><li> subcutaneously immunodeficient 누드 마우스에 세포 혼합물을 주사. CAFs는 여러로부터 독립적으로 추출하는 경우종양, 여러 마우스의 좌우 측면에 각 혼합물을 이식. </li></ol> 3B. immunodeficient 마우스로 인간 섬유아 세포의 mammary 분사 <ol><li> EXP - CAFs에 대한 제어 섬유아 세포를 생성하려면, 50 % (V / V) Matrigel 당 분사 (그림 1Bb)와 문화 매체 400 μl에 P2.2에서 생성된 3x10 6 GFP + puro R 불후의 인간 mammary 섬유아 세포를 준비합니다. 암종 세포와 섬유아 세포를 혼합하지 마십시오. </li><li> 누드 마우스의 피하 사이트에 P3b.1에서 준비한 섬유아 세포를 이식. </li></ol> * 주사 섬유아 세포는 피부 아래의 조직 fibroblastic 아니라 종양을 형성됩니다. 4A. 종양의 이종 이식의 해부 <ol><li> 때 다른 암종 세포 및 / 또는 섬유아 세포가 coimplanted되는 42일 후 주입 (그림 1Ba). * 참고 피하 인간의 유방암 이종 이식을 품고 마우스를 Euthanise, 섬유아 세포는 myofibroblastic 표현형를 시작 종양의 이종 이식 시간 초과 42일에 대한 incubated해야 할 수 있습니다. </li><li> 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 마우스의 측면에서 종양의 이종 이식을 수확. PBS에있는 종양 조직을 빠져. </li></ol> 4B. fibroblast의 이종 이식의 해부 <ol><li> fibroblast의 이종 이식 42일 후 주입 (그림 1Bb)을 품고 마우스를 Euthanise. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 피하 fibroblast의 이종 이식을 해부하다. PBS로 fibroblastic 조직을 넣으십시오. 작은 투명한 조직으로 표시되는 fibroblast의 이종 이식은, 피부 아래에서 찾을 수 어려울 수도 * 있습니다. </li></ol> 5. xenografts에서 기본 교양 세포의 준비 <ol><li> 종양 (~ 0.5 g) 또는 fibroblastic 조직 (~ 0.1 g) 해부하다에 대한 살균 biosafety 캐비닛을 사용합니다. 15cm D 문화의 상단에 excised 조직을 전송PBS 1 ML 함께 분에. 멸균 면도날을 사용하는 작은 조직 조각 (&lt;1.5 mm 3)로 조직을 말하다. * fibroblast의 이종 이식 미만 0.1 그램 무게 경우, 몇 가지 추가 fibroblast의 xenografts를 수집하고 고립에 대한 세포의 수를 늘리기 위해 그들을 함께 혼합합니다. </li><li> 세포 분리 버퍼 (조직 0.5 g 당 10 ML)와 최대 속도에서 1 분 와동을 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 조직 조각을 전송합니다. </li><li> 37 3 H에 대한 세포 현탁액을 품어 ° C 연속 느린 동요와 함께. </li></ol> 6. 문화에 puromycin 방지 세포의 분리 <ol><li> 250 X g에서 5 분 또는 종양 이종 이식에서 fibroblast 중 dissociated 세포 현탁액을 원심 분리기와 PBS의 세포 펠렛을 resuspend. 250 X G.시 5 분 다시 원심 분리기 10% FCS - DMEM의 결과 세포 펠렛을 Resuspend. 37 puromycin의 존재 (1 μg / ML)에서 15cm 배양 접시에있는 문화 세포 ° C그리고 순서대로 5 % 이산화탄소는 오염 암종 세포 및 / 또는 murine stromal 세포를 제거합니다. 합류 (2~4주)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. * 참고 그 결과 puro R 세포, 지정 42 일 된 EXP - CAF1 (그림 1Ba)하거나 Control fibroblast - 1 세포 (그림 1Bb), 불사신 및 GFP 양성하고 있습니다. 그것은이 세포가 같은 P2.3 - 6에 설명된 10T1 / 2 세포를 사용하여 활성 바이러스를 생산 있는지 확인하는 것이 좋습니다. </li></ol> 7A. 문화의 EXP - CAF2 세포의 분리 더 CAFs의 활성 myofibroblastic 표현형을 높일 수있는, MCF - 7 - RAS 세포와 42 일 된 EXP - CAF1 세포를 섞어 200 일 추가 기간 동안 누드 마우스에 subcutaneously 그들을 다시 주입. 해부하다 및 puromycin (1 μg / ML)의 존재에서 10 % FCS - DMEM과 15cm 배양 접시에있는 단일 세포 현탁액 문화 세포에 종양의 이종 이식을 떼어 놓다, 같은 P6에 표시된0.1. 합류 (80~10일)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. 그 결과 puro R 전지는 242 일 된 EXP - CAF2 전지 (그림 1Ba)라는 이름입니다. 7B. 문화의 제어 fibroblast - 2 세포의 추출 EXP - CAF2 세포에 대한 제어 섬유아 세포를 생성하려면, 200 일 동안 추가로 누드 마우스에 subcutaneously 암종 세포없이 혼자 42 일 - 오래된 제어 fibroblast - 1 세포를 주입. 해부하다하고 P6.1에 표시된 puromycin (1 μg / ML)의 존재에서 10 % FCS - DMEM과 15cm 배양 접시에있는 단일 세포 현탁액과 문화 세포에 fibroblastic 조직을 떼어 놓다. 합류 (3-4 주)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. 그 결과 puro R 전지는 제어 fibroblast - 2 세포 (그림 1Bb)라는 이름입니다. 8. 대표 결과 : 제어 fibroblast - 2 및 EXP - CAF2 cel유방 종양의 xenografts에서 추출한되었습니다 있나요은, 인간의 의미, 인간의 특정 vimentin, prolyl - 4 - hydroxylase, 콜라겐 1A, fibronectin, S100A4와 fibroblast 표면 단백질 (그림 2A) 11를 포함하여 mesenchymal 마커에 대해 강력하게 긍정적인 스테인드 원산지 및 이들 세포 mesenchymal 자연. 반대로, cytokeratin, 상피 세포의 마커는,이 GFP + 섬유아 세포 (그림 2B)에 스테인드되지 않았습니다. 이러한 연구 결과는 따라서 압축을 푼 EXP - CAF2 및 제어 fibroblast - 2 세포가 처음 마우스 xenografts에 소개 부모의 인간 mammary 섬유아 세포에서 유래했다고하는 것이 좋습니다. 중요한 것은, EXP - CAF2 세포의 높은 비율은 α - SMA 42 일 된 EXP - CAF1 및 제어 fibroblast - 2 세포 (그림에 비해 myofibroblasts의 표시 둘 중 세포외 기질 당단백질 tenascin - C 5에 대한 긍정적인 스테인드 . 2C, D) 11. 이러한 데이터는 해당 거주 인간 mammary fibr를 나타냅니다oblasts는 점진적으로 종양의 xenografts 내에서 카페인 myofibroblasts로 진화. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> 인간 섬유아 세포의 mammary 고립의 그림 1 도식 표현. A) 감소 mammoplasty 조직은 무균 면도날 (P1.2)을 사용하여 다진과 15 ML 원뿔 튜브 (P1.3)에 양도되었습니다. 작은 조직 조각은 세포 분리 버퍼 (P1.4)에 소화와 체외 (P1.5 - 7)의 문화에 대한 준비가되었습니다. , 격리 기본 인간의 mammary 섬유아 세포, hTERT와 GFP를 모두 표현하는 retroviral pMIG (MSCV - IRES - GFP) 벡터를 immortalise하기 위해 도입되었고, 그 결과 GFP 양성 세포는 유동세포계측법 (P2.1)을 사용하여 정렬되었습니다. puromycin 저항 유전자를 인코딩 retroviral pBabe - puro 벡터는 다음이 세포에 도입되었다. puromycin 처리시, GFP - 라벨 (GFP +) puromycin 모성 (Puro R), immortaliSED 인간 mammary 섬유아 세포는 (P2.2) 고립되었다. 바)을 생성하려면 EXP를 CAFs, GFP + puro R은 불후의 인간 mammary 섬유아 세포는 subcutaneously immunodeficient 누드 마우스 (P3a)에 MCF - 7 - RAS 유방 암종 세포와 coinjected되었습니다. 종양의 이종 이식은 이식 후 42일 (P4a)에 resected와 단일 세포 현탁액 (P5)에 dissociated되었습니다. 이러한 전지는 다음 어떤 오염 암종 세포와 마우스 stromal 세포 (P6) 제거하는 puromycin의 면전에서 체외에서 배양해되었습니다. 그 결과 puromycin 모성 전지는 실험적으로 생성 CAF1 (EXP - CAF1) 세포를 칭했다되었습니다. 42일 포스트 주입 resected 이러한 세포, MCF - 7 - RAS 세포와 다시 혼합되었고 (P7a) 이전과 호스트 마우스에 이식한 subcutaneously. 그 결과 종양은 다음 해부 dissociated 및 puromycin의 면전에서 교양 200 일간의 추가 기간 동안 성장을 허용했다. 격리puromycin 모성 전지는 EXP - CAF2 세포를 (242 일 된) 칭했다되었습니다. EXP - CAFs에 대한 제어 세포를 분리하기 위해 BB), GFP + puro R 인간 mammary 섬유아 세포가 MCF - 7 - RAS 전지 (P3b)없이 순수한 문화로 누드 마우스에 주입했다 subcutaneously 불후. 해부 fibroblastic 조직은 42일 후 주입 (P4b)는, 제어 fibroblast - 1 세포라는 단일 셀 정지 (P5)과 puromycin 방지 세포로 dissociated되었습니다 앞에서 설명한대로 (P6) 고립되었다. 이 섬유아 세포는 다시 한번 이백일 (P7b)에 대한 추가 MCF - 7 - RAS 세포가없는 누드 마우스에 이식한 subcutaneously했다. fibroblastic 조직은 dissociated, 해부 및 puromycin의 면전에서 교양되었습니다. 격리된 puromycin 모성 전지는 제어 fibroblast - 2 세포를 (242 일 된) 칭했다되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> 그림 2 <st룽은&gt; 특급 - CAFs 및 제어 섬유아 세포 부모의 인간 mammary 섬유아 세포에서 발생한. (A) 제어 fibroblast - 2 (제어 F.) 및 EXP - CAF2 세포 Immunofluorescence 분석합니다. 셀 유형 모두 prolyl - 4 - hydroxylase 인간 vimentin, 콜라겐 1A, fibronectin, S100A4와 fibroblast 표면 단백질을 포함 mesenchymal 표시 (적색)에 대한 긍정적인 얼룩. (B) 대조적으로, 범 - cytokeratin, 상피 세포의 마커 , GFP (녹색)를 표현 EXP - CAF2 세포에서 발견되지 않습니다. 세포 핵은 4&#39; - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) (파란색)와 스테인드 있습니다. 스케일 바, 50 μm의 (코지마 외로부터 추천받은 11.) α - SMA (적색) 또는 tenascin - C (TN - C) (적색)에 대한 항체를 사용하여 EXP - CAF2 전지 및 제어 fibroblast - 2 세포 (제어 F.)의 (C) Immunofluorescence. 세포 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드 있습니다. 스케일 바, 50 μm의. EXP - CAF2 세포 (D) 48 % 1 반면, α - SMA에 대한 긍정적인 얼룩42 일 된 EXP - CAF1 4 %와 컨트롤 fibroblast - 2 세포 인구의 2.5 %는 α - SMA 양성하고 있습니다. (코지마 동부 표준시 al.11의 추천)

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

CAFs이 셀 유형 자체가 도전의 특성을 렌더링 사이 CAF 특정 마커와 이질 수준의 부족 관찰했다. 체외에서 공부 CAFs 또한 이러한 세포가 senesce하고 오랜 기간 동안 교양 때 proliferating 중지되는 추가 합병증에 의해 방해되었다. 직접 retroviral hTERT cDNA 구조를 사용하여 기본 CAFs을 immortalise에 대한 우리의 이전의 시도가 실패했습니다. 따라서 더 이상 이러한 세포의 특성을 홍보하는 종양을 조사하...

<table border="1"><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10,270 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I </td><td></td><td> 시그마 </td><td> C0130 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> hyaluronidase </td><td></td><td> 시그마 </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin (V9) 항체 </td><td></td><td> Novocastra 연구소 </td><td> NCL - L - VIM - V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC - 8) 항체 </td><td></td><td></td><td></td><td> 의 선물 박사 <stroNG&gt; 루치아노 Zardi </td></tr><tr><td> α - SMA - Cy3 (1A4) 항체 </td><td></td><td> 시그마 </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl - 4 - hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) 항체 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 type1 1A 항체 </td><td></td><td> 시그마 </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> 팬 - cytokeratin 항체 </td><td></td><td> 시그마 </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin 항체 </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610,077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblast - 특정 단백질 - 1) 항체 </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast 표면 단백질 (클론 1B10) 항체 </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> MSCV - IRES - GFP 구축 </td><td></td><td></td><td></td><td> 작성자 요청 </td></tr><tr><td> pBabe - puro 구축 </td><td></td><td></td><td></td><td> 구매 Addgene에서 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td></td><td> 시그마 </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> 시그마 </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td></td><td> 코닝 </td><td> 430,766 </td><td></td></tr><tr><td> 누드 마우스 </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU - F </td><td> 여성 NCR 누드 </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 세포 </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL - 226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Carcinomas는 종양 세포의 &#39;기질&#39;이라고 비 암 구획 구성되어 복잡한 조직입니다. 기질은 세포외 기질 (ECM) 및 섬유아 세포, myofibroblasts, 내피 세포, pericytes과 1-3 leukocytes을 포함 mesenchymal 세포의 다양한 구성되어 있습니다. 종양 - 관련 기질은 인근 암종 세포에 의해 발표 상당한 paracrine 신호에 반응합니다. 질병 과정 동안 기질은 종종 myofibroblasts 다수 포함하는 암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs)에 의해 인구가됩니다. 이러한 세포는 이전에 자신의 체외 문화에 대한 인간의 carcinomas 다양한 종류의에서 추출되었습니다. CAFs의 subpopulation는 α - 부드러운 근육 굴지 자신의 최대 규제 (α - SMA) 표현 4,5 통해 구별할 수 있습니다. 이러한 세포들은 myofibroblasts C와 유사한 특성을 공유하는 &#39;활성화 섬유아 세포&#39;의 특징 아르ommonly 부상하고 fibrotic 조직 6 보여집니다. 이 myofibroblastic CAF 집합의 존재는 매우 고급 malignancies 관련하여 환자의 가난한 prognoses와 관련된 것입니다. 우리 자신을 포함한 많은 실험실, CAFs, immunodeficient 마우스로 암종 세포로 주입, 크게 tumourigenesis 70-10을 추진 능력이있다 것으로 나타났습니다. 암종 환자에서 준비 CAFs 그러나, 자주 지속적인 실험을 통해 자신의 이용을 제한 extensiveness 문화에 전파하는 동안 노화를 받고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 coimplantation의 유방 종양의 이종 이식 모델을 사용하여 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary 불후의 인간 mammary CAF 셀 라인 (EXP - CAFs) 생성 소설 기법을 개발했습니다. 감소 mammoplasty 조직에서 얻은 EXP - CAFs, 부모 mammary 인간 섬유아 세포를 생성하기 위해서는 먼저 immortali되었습니다hTERT, telomerase의 holoenzyme의 촉매 subunit와 표현 GFP 및 puromycin 저항 유전자에 설계와 함께 SED. 이러한 세포는 이종 이식 마우스에 활성 RAS의 oncogene (MCF - 7 - RAS 세포)를 표현 MCF - 7 인간 유방암 세포 암종과 coimplanted되었습니다. 생체내의 배양 기간 후, 처음 주입 인간 mammary 섬유아 세포들은 puromycin 저항 11에 기초하여 종양의 xenografts에서 추출한되었습니다. 우리는 myofibroblastic 표현형을 채택, 상주 인간 mammary 섬유아 세포가 차별화된 것을 관찰하고 종양의 진행 과정 동안 종양 - 홍보 속성을 인수했다. 중요한 것은,이 세포는 EXP - CAFs로 정의, 가깝게 환자에서 해부하는 유방 carcinomas으로부터 격리 CAFs의 종양 - 홍보 myofibroblastic 표현형을 모방. 우리 종양 이종 이식 - 파생 EXP - CAFs 따라서 인간 부러 뜨려에 CAFs의 생물학을 공부하는 효과적인 모델을 제공합니다t의 carcinomas. 설명 프로토콜은 또한 인간의 carcinomas의 다른 유형에서 파생된 다양한 카페의 인구를 생성 및 특성화 연장 수 있습니다.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K 조회수.  University of Manchester. 암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.

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Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

연구

의학

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

인간 내유 동맥 (IMA) 이식과 Stenting : 인 Restenosis 스텐 트의 개발을 공부하는 인간 모델

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

실험 인간 폐렴의 운송

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 섬유 아세포

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...