この作品は、ビル·アンド·メリンダ·ゲイツ財団（SBGへグランドチャレンジ探査賞）、健康の研究（NIHR）、微生物病におけるバイオメディカル研究センター、NIHR総合現地研究ネットワークのための国立研究所によって資金を供給された。我々はインフラ支援のためNWDAを認める。我々は、肺炎球菌分離株のために教授がJ·Nワイザー、ペンシルベニア大学教授P Hermansの、ナイメーヘン大学に感謝します。写真を撮るための支援と助言に汎用CPUを安全委員会に、参加のためのすべての私たちのボランティアへとマチューBangertに感謝します。

1。選択とスクリーニングをボランティア<ol><li>健康なボランティアは、NHSの研究倫理委員会のガイダンスに従ってポスター広告を通じて、大学のウェブサイト上で募集しています。 </li><li>参加のための選択基準は以下のとおりです。 <ol><li> 18から60歳の成人。 </li><li>流暢な英語を話し、携帯電話やテキストメッセージの両方で容易に通信することが可能である。 </li></ol></li><li>参加のための除外基準は以下のとおりです。 <ol><li>リスク個人（子供、免疫抑制大人、高齢者、慢性病気）でと連絡を閉じます。 </li><li>現在の喫煙者や重大な喫煙歴（&gt; 10パック年）。 </li><li>喘息や他の呼吸器疾患。 </li><li>妊娠。 </li><li>ペニシリンまたはアモキシシリンにアレルギー。 </li><li>観察しない限り、または非介入段階で別の臨床試験で現在の関与。 </li><li>完全にインフォームドコンセントを与えることができません。 </li></ol></li><li>初期スクリーニング訪問、接種する前に、約1週間は、焦点を絞った病歴とターゲット臨床検査が含まれています。 </li><li>以前に認識されていない異常が見つかった場合は、ボランティアは研究から除外され、適切な調査がプライマリケアを介して配置されます。 </li><li>初期スクリーニングで白血球数が接種を訪問する前に、通常の範囲内であることを確実にするために求められるフル血球数を参照してください。鼻洗浄は、（6.1を参照してください）​​自然な肺炎球菌のキャリアを排除するために行われる。 </li><li>接種の前に、ボランティアが研究への参加に伴うリスクについて教育されており、救急患者のリーフレット、デジタル温度計、緊急電話番号とアモキシシリンの3日間コースが設けられている。 </li></ol> 2。接種株の作製<ol><li>接種株の調製はクリーンな環境で行わなければなりません。ピペットは使用のみ使用されるべきである接種の準備のためのD。すべてのガラスやプラスチック容器は、無菌でなければならない。我々は、接種株は、専用fumehoodとインキュベーターを用いて、専用の部屋で準備することをお勧めします。 </li><li>肺炎球菌の菌株は血液寒天プレート上に接種されています。プレートを5％CO 2下で一晩37℃でインキュベートする。翌日は、すべての細菌が血液寒天プレートから掻き取り、ビード株式保全システムに接種する。これらのビーズを取り揃えており、接種の在庫準備のために使用されます。接種の在庫を準備する前に、汚染やコロニーの均一性のためにビーズ銘柄をテストします。 </li><li>接種の在庫を準備するには、プレート全体をカバーするためにストリーキング、希望肺炎球菌血清型ビーズストックから2ビーズで血液寒天プレートに接種する。 2晩、5％のCOで37℃でプレートをインキュベートする。それ以降のすべてのインキュベーションは、これらと同じ条件を使用します。また、無菌性を確保するために一晩Vegitoneメディアをインキュベートする。 </li><li>翌朝綿棒2分の1プレートは、任意の血液寒天培地を除去し、あらかじめ温めておいたVegitoneブロスの12ミリリットルに追加しないように注意してください。プレートの残りの半分を使用して繰り返します。濁度の変化が明らかになるまで、2時間または37℃で2つの12 mLバイアルを残して、いずれか早い方。 </li><li>あらかじめ温めておいたVegitoneブロス40mlに12ミリリットルを加え、よく混ぜる。他の12 mlバイアルに対して、この手順を繰り返します。これは、時点= 0です。 600nmでの光学密度（OD）を読むために100μlを削除します。マイルズとMisraの（M＆M）は7でメソッドのバリエーションを使用してコロニー形成単位（CFU）のカウントによって細菌の定量化のための20μlを削除します。両方のバイアルをインキュベートする。 <ol><li> M＆Mのために、6つのセクションに血液寒天プレートを分割します。 96ウェルプレートの6ウェル（U底）に滅菌PBS 180μlを添加する。トップだけでなく、ミックスにブロスの20μlを添加する。逐次サンプル一時10 6倍に希釈し、第六ウェルから20μlを捨てる。ウェルの最初のセクションに先頭から310μlの水滴を置き血液寒天プレート。 5他のウェルについて、この手順を繰り返します。それが反転してインキュベートされる前に、板が乾燥していることを確認します。 </li><li>翌日は各希釈部と記録に見えるコロニー数をカウントします。 30と300の間の数で希釈セクションを使用して、平均値を得ることが3によって可視コロニー数を割る。 </li><li>希釈率をコロニー数の平均値を乗算した後、10（10μlの降下量）で割ります。これは、CFU /μlで与える。 </li><li> CFU / mlを得るために1000でこの数値を掛けます。 </li></ol></li><li>早い中間対数期に達するまで0.25のOD、毎時のM＆M法による細菌のOD 600が測定値と定量を行う。 </li><li>この外径に達すると、1バイアルに滅菌10％グリセロールを追加し、1mlのアリコートを準備します。 -80℃でアリコート℃で保存し</li><li>より濃縮された株式については、15分間3345 xgで他のバイアルを遠心分離し、上清を除去する。 Vegitonの22.5ミリリットルでペレットを再懸濁し電子媒体及び10％グリセロールを追加します。 -80℃で1mlアリコートとストアを準備℃に</li><li>解凍および定量化する前に、少なくとも48時間、-80℃で株式を残す。 </li><li> M＆Mの方法により凍結細菌株を定量化する。再現性を確保するため、個別に3在庫管をテストします。後述するように、生理食塩水で所望の接種濃度に株式を希釈するために取得した値を使用します。 </li><li>接種については、接種で肺炎球菌の量は接種前と後に計算されます。 M＆M法による細菌のこの定量化は、それが全体の手順を完了するのにかかる時間を占める接種で肺炎球菌の平均数を決定するために使用されます。 <ol><li>所望の濃度に希釈し、接種を準備して、 &quot;事前接種&quot;カウントのためのM＆M法により定量を行う。 </li><li>我々の臨床研究施設では、全体の接種の手順を完了するには、チームで30分かかります。 Pnは生理食塩水でeumococcal懸濁液は、通常、この間隔の減少カウントが表示されます。これを説明するために、我々は30分間室温で希釈した接種座り込みを聞かせて、その後のM＆M法による細菌の &quot;接種後&quot;定量を行う。 </li><li>最終接種濃度を決定するために前後の平均を取る。あなたの臨床試験計画書によると、 &quot;座っている&quot;の時間を調整しますが、できるだけ簡潔に間隔を保つ。 </li></ol></li><li>すべて新株式は、株式の純度とアイデンティティの確認のための基準実験室に送られるべきである。 </li></ol> 3。接種の準備<ol><li>接種物の調製は、スケジュールされたボランティアの接種の予定30分前に開始する必要があります。 </li><li> -80℃の冷凍庫から以前に作成した在庫管の1を取り出し、それを解凍し、3分間17000×gで遠心チューブをスピン。 </li><li> 37℃インキュベーターで温かい血液寒天プレート。準備するM＆M法による細菌の定量化のための96ウェルプレートおよび所望の投与量に応じて希釈用チューブを準備します。 </li><li>遠心分離チューブからブロス上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。このステップでは、接種から培養液を除去します。 </li><li>遠心ステップを繰り返します。 </li><li>生理食塩水上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。 </li><li>希望接種濃度の希釈セットを実行し、M＆Mの方法により定量化する。 </li><li>ボランティア予定に接種を取り、ボランティアを接種した後、ラボで定量化を繰り返します。 -80℃での日付と接種量や店舗でチューブにラベルを付け℃に</li><li>接種から接種への一貫性を確保するために、それは同じピペットと専用の実験装置たびに使用することが重要です。 </li></ol> 4。接種<ol><li>ボランティアは、半臥位で快適に座っすべきである。 </li><li&gt; P200のピペットと滅菌フィルターチップを使用して接種の100μlを立て、ちょうど鼻腔の内側に先端を挿入します。 </li><li>ゆっくりと円を描くようにして鼻粘膜に接種を追放。 </li><li>それは、ピペットの先端が血流に入る細菌につながる可能性上皮の完全性の混乱として鼻粘膜に接触しないことが重要です。 </li><li>これは、接種しすぎて戻されていないか、またはそれが喉を実行されることも重要であり、それは鼻腔の内側に存在する必要があります。 </li><li>他の鼻孔についても同じ手順を繰り返します。 </li><li>ボランティアが鼻を盗聴または吹くことなく10分間、半臥位のままで持っています。これは、細菌が粘膜を横切って分散させるための時間を確保できます。 </li></ol> 5。監視<ol><li>ボランティアは、接種後に毎日監視されています。これは、午後2時前に調査官にボランティアによって送信された毎日のテキストメッセージが含まれています。 </li><li>テキストiの場合sは、ボランティアが彼/彼女の幸福を確保するために接続される2時までに受け取っていない。彼/彼女が応答しない場合は、親族の割り当てられている次は、ボランティアの福祉を確保するためにご連絡させていただきます。 </li><li>ボランティアは、すべての予定で任意の上気道症状を報告するように求められます。臨床スタッフは彼/彼女の症状を記述するためにボランティアをお願いし、苦情をフォローアップします。 </li><li>ボランティアに与えられた抗生物質は、次の3つの状況下で撮影するだけであり、彼らが体調不良であり、彼らは研究の終了時に肺炎球菌を運ぶか、またはそれらが体調不良であればしている場合は、研究チームがそれらを取るように指示された場合に研究チームに連絡することができません。ボランティアは、試験期間中にすべての回で一緒にこの緊急パックを維持することが奨励され、次の7日間、毎日のように研究チームに連絡することを要求され​​ています。 </li><li>私たちのチームは、HOのうち勤務時間中に看護師の連絡先と利用できる24/7であり、2つの医師が利用できるURS。全ての問い合わせは、電話の呼び出しおよび/または即時見直しによって対処されています。必要に応じて規定は、感染症病棟への即時、直接入学のために用意されています。 </li></ol> 6。鼻ウォッシュ（NW）手順<ol><li>鼻洗浄（NW）は、最初のスクリーニング訪問と同様、48時間、7日および14日、接種後に実行されます。使用NWメソッドはNaclerio らから取得されます。8ボランティアが自然に、S.によって植民地化肺炎球菌は、接種から除外され、フォローアップされています。 </li><li>ボランティアは、快適な姿勢で座っていると頭が垂直から戻って30°傾いている。 </li><li>で深呼吸をして口の屋根に対して後方に自分の舌を押し上げながら、自分の息を保持するためにボランティアをお願いします。この位置にしながら、ボランティアは、彼らは準備ができていることを通知するように頼まれます。 </li><li> 20mlの生理食塩水を充填したシリンジは前鼻の空間に挿入され、生理食塩水5mlを追放されています。 volunteerは、その後すぐに前かがみと箔ボウルに彼らの鼻を通して急速に吐き出すことにより、流体を排出する。 </li><li>この手順を各鼻孔を2回洗浄されており、完全な20ミリリットルが用いられてきたように、3回繰り返します。 </li><li>遠心管中で一緒にプールのすべてのサンプルを処理し、室温で実験室に送る。 </li></ol> 7。鼻洗浄処理<ol><li> 3345×gで10分間サンプルを遠心分離します。 </li><li> -80℃で標識したエッペンドルフチュー​​ブに1 mlアリコートとして清とストアを削除℃に</li><li>ペレットに媒体9 STGGの100μlを加えてよく混合します。この時点でチューブ内の総量が決定されることを確認します。この希釈は、キャリッジ正NWのCFUを計算する際に使用されます。 </li><li>プレートゲンタマイシン、ストリーク、プレート全体を含む血液寒天プレートに再懸濁したペレットを含むSTGG20μlのドロップ。 <ol><li> NWは、接種後の場合、再懸濁ペレットと、M＆M法による細菌の定量化のための使用を含むSTGGから10μlを削除します。 </li></ol></li><li> NWチューブにSTGGの別の800μlを加えてよく混合します。 </li><li>血液寒天プレートとチョコレート寒天プレート上に25μlの上にプレートを25μl、プレート全体をストリーキング。 </li><li> -80℃で2クライオバイアルとストアにメディアをSTGGに懸濁させ、残量の細菌を分ける℃に</li><li> 5％CO 2で37℃で一晩プレートをインキュベートする。 </li><li>肺炎球菌やその他の潜在的な呼吸器病原体のために翌日プレートを調べます。 </li><li>肺炎球菌は、コロニー形態によりプレートで識別されます。製図形態を有するα溶血性コロニーがoptochinディスクと血液寒天培地上で継代培養され、一晩インキュベートした。 </li><li> optochin小文字が区別され、推定肺炎球菌のコロニーはグラムグラム陽性diplococcusの複数形を確認するために染色し、Statens血清研究所PNEUを使用して血清型アールmotest-ラテックスキット。 </li></ol>

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	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

汎用CPUプラットフォームは、粘膜ワクチンモデルとして及び新規タンパク質ワクチンをテストするための保護の代用としての使用を含む、潜在的な用途の番号を持っています。この方法は、一貫性のある接種法および高品質北西に依存しています。 再現性は、接種との問題となることがあります。凍結細菌アリコートの可変的性質のために、それが所望の用量を複製することが困難な場合があります。所望の投与量の半減または倍増は範囲内と見なされます。これは、細菌の定量を正確CFUカウントによる細菌の定量化を決定するために、接種直前に - と、次のことを行うことが重要です。ボランティアの予定が1つだけの接種材料を調製し、接種の前後に行われ定量化めっきは別に最大30分に発生される必要があるように、同時に発生した場合このような理由からそれが役に立つかもしれません。 NWメソッドはcoopeが必要ですボランティアの配給と子どもの理想的な方法ではないでしょう。収率は5ミリリットル未満である場合は、プロシージャ名、エキストラ20ミリリットルまでを使用して繰り返すことができます。身に着けている入れ歯はNW収量が減少することがあります。ボランティアがブロック/鼻閉があり、生理食塩水を挿入した後前方に不足している場合は、鼻をかんで、少し戻って、さらに注射器を挿入し、背面より必要に応じて頭を傾けてください。 NWは練習で良くなるテクニックです。目的は、少なくとも10ミリリットルのリターンのためにあるように、いくつかのボリュームは通常失われてしまいます。ボランティアがNWの間生理食塩水を味わうことができるならば、後部咽頭、中咽頭との間の接続が適切にボランティアの舌によって閉鎖されていません。ボランティアはツバメ生理食塩水のほとんどをした場合、口の屋根に対して舌の押し出しを強調し、再度この手順を説明します。その後、ボリュームは返さ高めるための手順を繰り返します。 NWはsubstantが含まれている場合粘液のIAL量は、それが遠心分離する前にそれを削除するのが最善の方法です。渦粘液にバインドされていて、可能な限り少ない生理食塩水などを除去しながら、可能な限り大規模な作品のを取り除くかもしれない何かを緩めするようにサンプル。 アメリカでは以前の研究では、汎用CPUを無事に完了し、有害事象11を持っていなかった。汎用CPUプラットフォームの継続的な安全性を確保するために、我々は研究チームに24時間アクセスのまわりで基づいている緊急プロトコルを設定している。ボランティアは、彼らが一日研究チームに24時間にアクセスできるように、連絡先の詳細を与えられている。必要なすべての医療はリバプール大学王立病院で提供されています。保護の更なる対策として、臨床医、研究グループ外からの科学者からなる安全委員会が毎週の安全性報告書を受け取ります。レポートには、各ボランティアが受信し、何らかの症状や病気が報告されたかどうかの細菌量を含んでいます。このレポートでは、目の安全性を可能にする外部バイアスなしで批判する電子研究。安全委員会緊急時の万が一にも一日24時間ご利用いただけます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> 猫＃ </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0.9％塩化ナトリウム</td><td> B.ブラウン</td><td> 3627667 </td></tr><tr><td>粉ミルクをすくい取る</td><td>フルカ</td><td> 70166 </td></tr><tr><td>トリプトン大豆ブイヨン</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 211768 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> chocolated馬の血を持つコロンビア寒天培地</td><td>オキソイド</td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotestラテックスキット</td><td> Statens血清研究所</td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

肺炎球菌の鼻咽頭保菌は、伝送と侵襲性疾患の前提条件の主要な供給源でもあるので、実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ（汎用CPU）は、科学的に重要である。キャリッジの機種は、保護の免疫相関の正確な決定は、キャリッジの免疫効果は、鼻咽頭ニッチにおける病原体上のホスト·圧力の影響を許容するでしょう。さらに、ワクチンの研究を含む疫学的研究に有用キャリッジ検出の方法は、比較することができます。 目指す我々は、ワクチンによって誘導される免疫の代用としてキャリッジの防止にダウン選択候補小説の肺炎球菌ワクチンに使用することができる安全で有用な再現性のある方法である汎用CPUプラットフォームを開発することを目指しています。これは、汎用CPUとcarriaからワクチン防御のメカニズムの候補ワクチンと説明の試験に取り組んでいきますGE 1。新しいワクチンは現在のワクチンは、非菌血症肺炎に対して最適な保護を与えないように緊急に必要とされると非ワクチン血清型2から4と ​​血清型交換の証拠があったものの、肺炎球菌に対する現在の共役ワクチンは侵襲性疾患から子供を守る。 方法我々は、Sで接種する肺炎は、生理食塩水100μlに懸濁した。安全性は、汎用CPUモデルの開発における主要な因子であり、集中的なボランティアのスクリーニングおよびモニタリングを通じて達成されます。研究から独立している臨床医と科学者で構成される安全委員会が毎週のように客観的なフィードバックを提供します。 細菌接種は、標準化されており、動物性製品はボランティア（野菜ベースのメ​​ディアや生理食塩水）に接種されていないことが必要です。植民地化（10 4〜10 5）に必要な用量は、はるかに低い股関節アールnのものは、動物モデル（10 7）5で使用した。比較的粘液無料鼻洗浄は、肺炎球菌キャリッジを大音量によって強化されて検出（理想的には&gt; 10ミリリットル）。このプロトコルは、順番にプロトコルの中で最も重要な部分を扱います。これらの（a）はボランティアの選定、（b）は肺炎球菌接種の準備、（c）の接種、（d）のフォローアップと、（e）キャリッジ検出されています。 結果我々の現在のプロトコルは、2つの異なる細菌の血清型6を使用して、用量の範囲で、100以上のボランティアで安全になっています。 Sを使用して用量範囲の研究肺炎 6Bおよび23Fは、現在50％のキャリッジのための最適な接種用量を決定するために実施されています。キャリッジの50％率は汎用CPUモデルは小規模な研究番号とワクチンの有効性のための高感度を持つことができるだろうと予測。

我々は、経験が、35は肺炎球菌を実施しているそのうちの159人に接種した。我々は血清型6Bを使用してキャリッジを達成した最低用量は、最高用量は鼻孔あたり313000 CFU/100μLであった、鼻孔あたり11100 CFU/100μLであった。我々は血清型23Fを使用してキャリッジを達成した最低用量は、最高用量は鼻孔あたり84500 CFU/100μLであった、鼻孔あたり9000 CFU/100μLであった。 キャリッジアセスメントの我々の方法は、最近の研究では10人のボランティアのうち91％が鼻咽頭スワブより快適に鼻洗浄を見つけたことを示したので、選ばれた鼻洗浄、である;鼻洗浄はまた、微生物培養を用いた病原体を検出する可能性が高くなりました。 NWを接種し、血液寒天プレート上で回収された微生物叢が読み変数とが困難な場合があります。ゲンタマイシンは肺炎球菌を選択するために最初の血液寒天プレート上で使用されています。チョコレート寒天プレートと第2の血液寒天プレートは、他の潜在的な呼吸のパスを検出するために使用され肺炎球菌のコロニー形成を助けたり、妨げになるかもしれogens。読みやすいNWを接種血液寒天プレートの例を図1aに示します。フローラの数多くの種類を含む困難なプレートは 、 図1bに示されている。 すべての予定のボランティアで、任意の上気道症状を説明するように求めていた、存在する場合は、キャリアと非キャリア間の比較が強調された。最近、肺炎球菌を接種した145人のうち、28は（ 表1）の症状を訴えた。これらのうち8人が20でなかったキャリアがあった。最も一般的な症状は、非特異的鼻症状（ 表1）であった。発熱および/または倦怠感などの全身症状を、そこに報告され、実施調査の未肺炎球菌疾患や症状の証拠を示さなかった例の扁桃炎の1症例を除いて同時ウイルス感染と一致していました。二つ肺炎球菌positiv電子ボランティアは抗生物質で治療した。一つは、喉の痛みと耳の痛みを訴えたと、研究の医者と会った後、予防措置として抗生物質を服用することをお勧めしました。他のボランティアは、扁桃腺炎と臨床的に診断された。すべてのボランティアは、症状の迅速な解決を持っていた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> 図1。 NWを接種血液寒天プレート。北西を接種し、血液寒天プレートが読みにくくなることがあります。1aにはっきりと見える肺炎球菌と読みやすい板の一例であり、図1Bはもっとそれを作る共同植民地植物の多くが付いているプレートです肺炎球菌が存在しているかどうかを検出するのが難しい。 <table border="1"><tbody><tr><td> 症状 </td><td></td><td> キャリッジ（N = 32） </td><td> 改行なしていない（N = 112） </td></tr><tr><td>すべて症状</td><td></td><td> 24パーセント</td><td> 18パーセント</td></tr><tr><td>全身の</td><td>発熱</td><td> 3パーセント</td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td></td><td>倦怠感* </td><td> 9パーセント</td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td>ローカル</td><td>耳</td><td> 9パーセント</td><td> 3パーセント</td></tr><tr><td></td><td>鼻</td><td> 0 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td></td><td>喉</td><td> 12パーセント</td><td> 3パーセント</td></tr></tbody></table> 表1。ボランティアのキャラは S以下の症状が報告され肺炎 6B接種はすべての苦情は完全な調査に続いて、外部の安全委員会が検討したが、全く症状は肺炎球菌疾患に起因しなかった。最も一般的な症状は、喉の痛み、鼻の剥製やインフルエンザ様疾患であった。

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ、キャリッジの自然なモデルとワクチン開発で使用するための潜在的なモデルを提供しています。この技術は貴重まだ複雑で、人間に病原体を導入することにより、臨床的リスクを伴います。私たちは詳細なプロトコルを開発した。

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K ビュー.  Liverpool School of Tropical Medicine. 実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ、キャリッジの自然なモデルとワクチン開発で使用するための潜在的なモデルを提供しています。この技術は貴重まだ複雑で、人間に病原体を導入することにより、臨床的リスクを伴います。私たちは詳細なプロトコルを開発した。

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

実験的転移アッセイ

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

医学

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

人間の伏在静脈のための手順<em&gt;生体外</em&gt;灌流および外部補強

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

ラットの生殖実験における超音波検査

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.