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PART I：病原体同定 1。試料調製 注：以下のプロトコルに記載されているように全体の分子のワークフローは、分子診断の品質保証3の推奨に従って実行する必要があります。 <ol><li> 10倍希釈サンプルになるように1.5 mlの反応チューブにNaClを0.9ミリリットル0.9％に血液培養の0.1mlのアリコートを追加します（定量PCR阻害を防ぐために希釈）。 </li><li>ペレット細菌DNAの5分間13400×gでサンプルを遠心分離します。 </li><li> 100μlの滅菌脱イオンH 2 Oの細菌ペレットを再懸濁し</li><li> 4°Cまで、さらに使用時にDNAサンプルを格納します。 </li></ol> 2。同定アッセイ：リアルタイム16S rDNA塩基PCR <ol><li>次のように反応混合物を準備します。アッセイは、サンプルごとに4つの別個の反応で構成されています。各混合物は12.50μlのマスターが含まれていますミックス、0.9μMフォワードプライマー（5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3）7、0.6μMリバースプライマー（5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3）8およびプローブのパネル。プローブの量は、以下の4つの別個の反応のそれぞれに対して与えられます。 </li><li>最初の反応は含まれています。 <ul><li> 0.2μMユニバーサルプローブ（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）8 </li><li> 0.2μMP.緑膿菌プローブ （5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1） </li></ul></li><li>第二の反応は含まれています。 <ul><li> 0.2μME.大腸菌プローブ（5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1） </li><li> 0.2μM、シュードモナス属。プローブ（5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ） </li></ul></li><li>第三の反応は含まれています。 <ul><li> 0.2μM ブドウ球菌属。プローブ（5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ） </li><li> 0.2μMS.黄色ブドウ球菌のプローブ（5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1） </li><li> 0.2μM エンテロコッカス属。 （5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1） </li></ul></li><li>第四反応が含まれています。 <ul><li> 0.2μMユニバーサルプローブ（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1） </li><li> 0.3μM 球菌属。プローブ（5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ） </li><li> 0.2μMS.肺炎プローブ（5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1） </li></ul></li><li> 20μlの合計体積に到達するために、滅菌脱イオンH 2 Oを追加します。 96ウェルPCRプレートのウェルに各反応混合物の20μlを追加します。 </li><li>各ウェルにサンプルの5μlを追加します。 </li><li> 96ウェルPCRプレートをシールする接着フィルムを使用しています。 </li><li>以下の最適なサーマルサイクリング条件を用いてABI PRISM 7900HTのリアルタイムPCRシステムでプレートを実行します。 <ul><li> 10分間50℃で予備加熱</li><li> 15分間95℃での初期変性</li><li>の42サイクル<ul type="circle"><li> 15秒間、95℃で変性</li><li> 1分間60°Cでアニール</li></ul></li></ul></li></ol> 3。結果の分析<ol><li>タブの分析の設定で0.1のCT解析のしきい値を調整します。 6エンド（サイクル）：15開始するベースラインの構成（サイクル）を絞り込むことができます。 </li><li>すべてのサンプルのサイクル閾値（Ct）値を記録します。正のようにPCRの結果を考慮するカットオフ値は35のCt値に設定することができます。血液培養中に存在する細菌の量は、35の下にCT-値を生成する、CFU / mlで10月11日から7月 10日までの範囲であった。 </li></ol> PART II：抗生物質感受性試験 4。血液培養陽性9から細菌の分離<ol><li>血液培養陽性ボトルから培養液5 mlを吸引し、血清セパレータチューブにそれを転送します。 </li><li> 10分間2000×gで血清セパレータチューブを遠心します。 </li><li>血清セパレータチューブから上清を捨てる。 </li><li>転送BAC0.9％食塩水に滅菌綿棒でチューブのゲル層からteria 0.5マクファーランド標準懸濁液が得られるまで。 </li></ol> 5。ミクロ力価プレートの接種<ol><li> 5×10 5 CFU / mlの懸濁液を形成する二重濃縮されたミューラーヒントンIIブロス中の0.5マクファーランド濁液を希釈する。 </li><li>抗生物質（ 表1）の選択を含むマイクロタイタープレートのウェルに、この懸濁液を追加します。 </li><li> 6時間37℃でマイクロタイタープレートをインキュベートします。 </li><li> 4℃（マイナス成長コントロールなど）懸濁液のアリコートを格納します。 </li><li>インキュベーションの6時間後、滅菌チューブに各ウェルの内容を転送するだけでなく、マイナス成長のコントロールサンプル4℃で保存された</li><li> 5分間16000×gでチューブを遠心します。 </li><li>慎重に、細菌ペレットを乱すことなく、上清を除去します。 </li><li>滅菌脱イオンHにペレットを再懸濁し<sUB&gt; 2 O </li><li>滅菌脱イオンH 2 Oで10倍のサンプルを希釈する</li></ol> 6。リアルタイム16S rDNA塩基PCR 10 <ol><li>次のようにPCR混合物を準備します。 <ul><li> 12.50μlのiQ SYBR Green Supermixを</li><li>前方に0.5μMプライマー16S-1（5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）11 </li><li> 0.25μMリバースプライマー16S-2（5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3）11 </li><li> 20μlの合計体積に対する滅菌脱イオンH 2 O </li></ul></li><li> 96ウェルPCRプレートのウェルにPCR混合物の20μlを追加します。 </li><li>各ウェルにサンプルの5μlを追加します。 </li><li> 96ウェルPCRプレートをシールする接着フィルムを使用しています。 </li><li>以下の最適なサーマルサイクリング条件を用いて、MyiQシングルカラーリアルタイムPCR検出システム上でプレートを実行します。 <ul><li> 4分間95℃での初期変性</li><li>初期には、°C 30秒65℃アニーリング</li><li> 35サイクル<ul><li> 9時変性15秒間5°C </li><li> 1分間60°Cでアニール</li></ul></li><li> （°C 0.57°C刻みで20分で60から95から）曲線解析を溶かす</li></ul></li></ol> 7。結果の分析<ol><li>下記式（抗生物質の種類によって異なります）のいずれかを使用してカットオフCt値を計算します。 <ul><li>一般的には： カットオフのCt値= Ct値プラス成長制御+ 0.5×（Ct値のマイナス成長制御- Ct値プラス成長制御） </li><li>ピペラシリン、グラム陰性桿菌でピペラシリン/タゾバクタムとセフタジジム、 黄色ブドウ球菌のアモキシシリン、オキサシリン及びトリメトプリム/スルファメトキサゾール、 エンテロコッカス属にアモキシシリン： カットオフのCt値= Ct値プラス成長制御+ 0.25×（Ct値のマイナス成長 。 コントロール- Ct値プラス成長制御） </li></ul></li><li>プラス成長コントロールとして滅菌脱イオンH 2 Oと共にインキュベートしたサンプルを使用します。</li><li>微生物に応じて、適切なマイナス成長のコントロールを使用します。 <ul><li>抗生物質の混合物とともにインキュベートしたグラム陰性桿菌のサンプル</li><li> エンテロコッカス属のサンプルは4℃で保存</li><li> 黄色ブドウ球菌のサンプルは4℃で保存</li></ul></li><li>次のようにテストされ抗生物質のために株の感受性（S）または抵抗（R）を決定します。 <ul><li>カットオフCt値よりも高いCt値は感受性を示します。 </li><li>カットオフCt値よりも低いCt値は、抵抗を示します。 </li></ul></li></ol> 8。代表的な結果二つのモデル生物、すなわちグラム陰性菌E.大腸菌とグラム陽性球菌黄色ブドウ球菌は 、細菌性病原体とその抗菌性プロファイルの決定の検出および同定のための結合された手順を視覚化するために選択されています。プロトコルの最初の部分では、病原体の識別を含んでいる。 SPEcificプローブは、8つの臨床的に関連する微生物の検出用に設計されています。細菌のパネルに含まれるターゲットの存在下で、増幅曲線が生成され、Ct値（ 図2）が計算されます。正のようにPCRの結果を考慮するカットオフ値は35のCT値に設定されています。 図2Aでは、 大腸菌に感染した血液培養の同定のプロファイルが表示されます。 16Sユニバーサルプローブは2つの独立した反応混合物に含まれており、その結果、2つの増幅曲線（25.20と25.95のCt）を生成しています。第3の信号は、E.のプローブ特定の場所から誘導される大腸菌 （27.04のCt）。 S.の識別黄色ブドウ球菌に感染した血液培養は、 図2Bに示されています。 16Sユニバーサルプローブは、33.35と33.71の増幅信号を持っています。残りの2つの信号が黄色ブドウ球菌属に特異的なプローブから派生しています。とS.黄色ブドウ球菌 （32.48と30.59のCt）。 図3にも示された大腸菌株を表す抗生物質感受性試験の増幅プロットの例です。 図2Aインチ各行には、細菌のサンプルをインキュベートしたことが1つの抗生を表しています。低CT値を持つサンプルでは、​​成長がテストされた抗生物質に対する抗生物質、を示す抵抗の存在下で発生したサンプルです。逆に、高いCt値は、試験した抗生物質に対する感受性を示す、全く成長が原因抗生物質の効果的な作業から発生していたサンプルを表しています。表1は、E.の抗菌プロファイルの測定を示しています大腸菌およびS.黄色ブドウ球菌分離株。すべてのCt値が報告され、プロトコル·テキスト（7.1）に記載されている数式を使用して、2つのカットオフのCt値が計算されています。抵抗性と感受性を区別するために分離されています。報告されたCt値が計算されたカットオフCt値（およびその逆）よりも低い場合株は抗生物質に耐性があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" /> rDNAのPCRリアルタイム16Sを使用して、病原体の同定と抗生物質感受性試験手順の図1のフローチャート。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" /> 図2識別アッセイ：。増幅プロットとサイクル閾値（Ct値）は、特定のプローブが原因病原体の同定に使用されている間、血液培養陽性は、普遍的な16S rDNA塩基プローブによって検出される。 E.を含む血液培養のA.増幅プロット大腸菌 、B. S.を含む血液培養の増幅プロット黄色ブドウ球菌 、Pseu AE、Pseudomon緑膿菌として、UNI、16Sユニバーサルプローブ、Ecoli、 大腸菌プローブ; Pseu SP、 シュードモナス属。プローブ、S.肺炎、 肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）プローブ、連鎖球菌属、 レンサ球菌属。プローブ、腸、 腸球菌属。プローブ、黄色ブドウ球菌、 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプローブと、黄色ブドウ球菌属、 ブドウ球菌属。プローブ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" /> E.の抗生物質感受性試験の図3の増幅プロット大腸菌 （サンプル1）を分離 。各曲線は歪みがでインキュベートしたもの抗生物質を表しています。早い信号はひずみがテストされた抗生物質の存在下で培養し、抗生物質に耐性があるので、したことを意味します高い細菌負荷によって引き起こされる。遅い信号はひずみが抗生物質の存在下で成長していないことを示している、言い換えれば、それは影響を受けやすくなります。 <table border="1"><tbody&gt; <tr><td> サンプル1：E.大腸菌 </td><td></td><td></td><td> サンプル2：S.黄色ブドウ球菌 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AST </td><td> CT </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> CT </td><td> R / S </td></tr><tr><td>アモキシシリンは8mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td>アモキシシリンは0.25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td>アモキシシリン - クラブラン酸8月4日mg / Lで</td><td> 17,36 </td><td> R </td><td>オキサシリン2 mg / Lで</td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td>ピペラシリン16 mg / Lで</td><td> 16,67 </td><td> R </td><td>バンコマイシン2 mg / Lで</td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td>ピペラシリン - タゾバクタム16 /4 mg / Lで</td><td> 24,15 </td><td> S </td><td>ゲンタマイシンが4mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td>シプロフロキサシンは1 mg / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td>トリメトプリム - スルファメトキサゾール38分の2 mg / Lで</td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td>セフタジジムは1 mg / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セフタジジムは8mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシンが4mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリメトプリム - スルファメトキサゾール38分の2 mg / Lで</td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイナス成長制御（抗生物質の混合物） </td><td> 30,41 </td><td></td><td>マイナス成長制御（サンプルは4℃で保存） </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td>プラス成長制御</td><td> 16,90 </td><td></td><td>プラス成長制御</td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カットオフ値は、CT-1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td>カットオフ値CT-1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td>カットオフ値のCT-2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td>カットオフ値のCT-2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> *アモキシシリン、アモキシシリン - クラブラン酸、シプロフロキサシン、gentamicについてトリメトプリム - スルファメトキサゾール、で **ピペラシリン、ピペラシリン - タゾバクタム、セフタジジムについて</td><td></td><td></td><td>バンコマイシンとゲンタマイシンのために*** ****アモキシシリン、オキサシリンおよびトリメトプリム - スルファメトキサゾールについて</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1。つのサンプル （ 大腸菌や黄色ブドウ球菌 ） の抗生物質感受性試験の定量 。 PCRアッセイのCt値は、自動的にプロトコルのテキストに示すように、数式を使用して、正と負の成長制御から2つのカットオフのCt alues​​を計算することができるように、このExcelファイルにコピーされています。抗生物質がカットオフCt値よりCt値低く表示されている場合はCt値がカットオフよりも高かった場合には、株は、抗生物質に耐性のある、ひずみが影響を受けやすくなります。

<ol>
	<li>Wallet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+clinical+study+using+a+multiplex+real-time+PCR+test+for+the+detection+of+bacterial+and+fungal+DNA+directly+in+blood.">Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).</li><li>Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rapid+detection+of+bloodstream+infections+on+length+of+hospitalization+and+hospital+charges.">Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).</li><li>Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l., Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostics+working+group.+Reflections+and+proposals+to+assure+quality+in+molecular+diagnostics.">Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics.</a> Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).</li><li>Peters, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+the+diagnosis+of+bloodstream+infections.">New developments in the diagnosis of bloodstream infections.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).</li><li>Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+probes+for+the+diagnosis+of+clinically+relevant+bacterial+infections+in+blood+cultures.">Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).</li><li>Beuving, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+of+grown+blood+cultures+by+combining+culture+and+real-time+polymerase+chain+reaction+is+rapid+and+effective.">Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+universal+antibiotic+susceptibility+testing.">Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).</li><li>Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+bacterial+load+by+real-time+PCR+using+a+broad-range+(universal)+probe+and+primers+set.">Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set.</a> Microbiol. 148, 257 (2002).</li><li>Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+susceptibility+testing+with+positive+BacT/Alert+blood+cultures+by+using+MicroScan+overnight+and+rapid+panels.">Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).</li><li>Vliegen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+by+real-time+amplification+and+sequencing+of+the+16S+rRNA+gene.">Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene.</a> J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).</li><li>Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MicroSeq+system+for+identification+of+mycobacteria+by+16S+ribosomal+DNA+sequencing+and+its+integration+into+a+routine+clinical+mycobacteriology+laboratory.">Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、病原体の迅速な同定を可能にし、それによって血流感染症患者の予後を改善する適切な抗生物質の早期投与につながる可能性があり機能的な抗菌性プロファイルを提供します。テスト、すなわち低コスト、高スループット、最小のターンアラウンド時間の要求条件に応じて、試験条件を調整することができます。全体の手順は、1営業日以内に行うことができます。また、プロトコルの2つの部分が大幅にターンアラウンド時間を短縮され、同時に実行することができます。ここで提示されるように、識別パネルには、私たちの病院の中で最も臨床的に関連する細菌の選択である。主な原則は、16S遺伝子領域を標的としているので、他の微生物に特異的なプローブの設計と分析を追加することができます。完全なアッセイは、もともと血液培養の迅速分析のために意図されていたが、Oの処理にも使用できます。熱のサンプル材料。また、これは抗生物質感受性試験のために使用された抗生物質の場合である：詳細やその他の抗生物質は地元の抵抗パターンとガイドラインに基づいて、追加することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>メルク化学品</td><td> 106404 </td><td>水で0.9％ </td></tr><tr><td>バキュテイナSST血清セパレータチューブ5ミリリットル</td><td> BD診断システム</td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td>ミューラーヒントンIIブロス</td><td> BD診断Dystems </td><td> 212322 </td><td>水に44グラム/ L </td></tr><tr><td> Rotixa 50 rsを遠心分離</td><td>アンドレアスHettich GmbH＆Co。KG社</td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機5415 D </td><td>エッペンドルフ</td><td>中止</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td> &lt;TD&gt;シグマアルドリッチ</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td>プローブ</td><td> Sigma-Aldrich/Appliedアプライドバイオシステムズ</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmentalマスターミックス2.0 </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQはSYBRGreen Supermixを</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズBV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td>アンペア光学96ウェル反応プレート</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td>アンペア光学接着フィルム</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQは96ウェルPCRプレート</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズBV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロシールB粘着シール</td><td>バイオ·ラッド労働党atories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR検出システム</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR検出システム</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズBV </td><td> MyiQシングルカラー</td><td></td></tr></tbody></table>

one-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures

血流感染症があるため、敗血症の可能性の症状、重症敗血症や敗血症性ショックの1の高死亡率に関連付けられています。したがって、適切な抗生物質療法の急速な投与は、血流感染症の治療における第一に重要である。このプロセスで重要な要素は、細菌の同定と抗生物質感受性試験の結果に大きく依存するタイミングです。これらのパラメータの両方が定期的に時間がかかり、平均24〜48時間、2、4にかかる文化ベースのテストによって得られる。研究の目的は、血流感染症の迅速な同定と同様に、迅速な抗菌薬感受性試験のためのDNAベースのアッセイを開発することでした。第1のアッセイは、種または属特異的プローブ5を補完する真正細菌16S rDNAのベースのリアルタイムPCRアッセイである。これらのプローブは、 シュードモナス属を含むグラム陰性菌を使用して、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、と大腸菌と同様にブドウ球菌属を含むグラム陽性菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌属、レンサ球菌属、肺炎球菌とは区別することができます。このマルチプローブアッセイを用いて、病原微生物の最初の同定は、2時間後に与えられた。 第二に、我々はS.の抗生物質感受性試験のために半分子アッセイを開発しました黄色ブドウ球菌、腸球菌属。と（通性）好気性グラム陰性桿菌6。このアッセイは、PCRは、細菌7の成長を測定するために使用された研究に基づいていた。血液培養から直接採取し細菌が抗生物質の選択で6時間インキュベートし、SYBRグリーンベースのリアルタイムPCRアッセイに続くのは、成長の阻害を決定しています。これら2つの方法の組み合わせは、同じ日（ 図1）適切な抗生物質療法の選択を指示することができます。結論として、同定および抗生物質感受性の両方の分子の分析は、病原体を検出するための高速な代替手段を提供し、血流感染の診断を向上させることができます。

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One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

細菌性病原体診断のための簡単​​な一日のワークフロースキームの設計は、血流感染症の迅速な認識を可能にします。 8臨床的に関連する細菌の目標とそれらの抗生物質耐性プロファイルの包含は、より適切な治療につながる可能性が同じ日に医師初期洞察を提供しています。

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.1K ビュー.  Maastricht University Medical Center. 細菌性病原体診断のための簡単​​な一日のワークフロースキームの設計は、血流感染症の迅速な認識を可能にします。 8臨床的に関連する細菌の目標とそれらの抗生物質耐性プロファイルの包含は、より適切な治療につながる可能性が同じ日に医師初期洞察を提供しています。

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

の識別のための1.5時間の手順腸球菌</em直接血液培養から>種

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

免疫・感染学

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

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Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

迅速な細菌同定および抗生物質感受性試験のための血液培養ペレットの調製

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.