この作品は、NEIとNIMHによって資金を供給された。

1。 VideoSwitcher 1.1。コンピュータにVideoSwitcherを接続する VideoSwitcher（図1）は、アナログビデオ（VGA）の入力を受け取り、陰極線管（CRT）カラーモニターを駆動するために使用されています。 VideoSwitcherを使用する前に、コンピュータのグラフィックカードはVGAポート（図2A）またはデジタル·ビジュアル·インタフェース（DVI-I）の両方のデジ​​タルおよびアナログビデオ信号を送信するポート（図2B）のいずれかを持っていることを確認します。 DVI-VGAアダプタ（図2C）はVideoSwitcherにDVI-Iポートに接続する必要があります。 コンピュータとモニタの電源を切り、コンピュータのグラフィックカードからモニタを外します。 付属のVGAケーブルを使用してVideoSwitcherの入力ポートにVGAまたはコンピュータのグラフィックカードのDVI-Iポートに接続します。接続を保護するために小型のドライバーを使用しています。 VideoSwitcher 1の出力ポートに、モニターのVGAケーブルを接続します。ndは接続を固定します。 付属の電源アダプタを使用して電源にVideoSwitcherを接続します。 コンピュータとモニタの電源をオンにします。 1.2。ビデオスイッチャーの二つの表示モード VideoSwitcherのスイッチボタンは、ユーザーが2つの表示モードに戻って行ったり来たり切り替えることができます。カラーモードでは、VideoSwitcherは、コンピュータのグラフィックカードからの映像信号を変更することはありません。グレースケールモードでは、ディスプレイには、輝度が少し赤チャンネルからの信号は、緑のチャネルからの寄与の影響を受け、グラフィックスカードの青チャネルからのビデオ信号によって主に決定すると、単色になります。 VideoSwitcher内部抵抗ネットワークは約128倍の赤チャネルからの信号を減​​衰させ、緑のチャネルからの信号は全く寄与しないためです。青の貢献の割合VideoSwitcherの出力にD赤いチャンネルは青対赤の比（BRratio）と呼ばれています。 BRratioは、ディスプレイのセットアップの独立したビデオスイッチャーのプロパティです。これは、各VideoSwitcher（1.3を参照）実験的に決定することができます。 表示モードは、Matlabの関数呼び出しを使用してグラフィックカードの緑のチャネルを介して特殊な信号を送信することによって切り替えることができます。 PsychVideoSwitcher（ &#39;スイッチモード &quot;、whichScreen、ToGrayMode）; ここで、グレースケールまたはカラーモードに切り替えるには1または0の手段ToGrayMode。 図3は、VideoSwitcherの概略を示しています。 1.3。測定BRratio BRratioは、方形波格子の検出タスクを使用して、各VideoSwitcherを測定することができます。方形波の2つのレベルは、RGB値などの（0、0、40）および（x、0、39）が割り当てられています。一つは、方形波格子まで、xの値を調整することができますその時点でのxの値がBRratioです--- B-チャネルの信号のいずれかのユニットによって生成された強度につながるRチャンネルの信号の大きさは、消えます。 1は、RGBの値（0、0、255）と（255、0、0）でVideoSwitcherの電圧出力の比を測定するために、例えば、電子的にBRratioを測定することができますが、精神物理学的方法は、ここで説明する非常に単純で、正確。 1.4。キャリブレーションを表示します。 ほとんどのモニタは、表示輝度は、コンピュータのグラフィックスカードで指定されたピクセルのグレーレベルに比例して増加していません。関係は次のように記述することができます。 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="式（1）" /> ここで、L maxと L minとγは、光度計を使用するか、心理物理手順と測光測定7,8の組み合わせのいずれかによって、ガンマ補正の手順で決定されます。ガンマキャリブレーションはimportanです。ディスプレイに正確なコントラストを生成するためにT;それは、各表示装置に実行する必要があります。 光度計では、単に、別のピクセルgraylevels（例えば、0〜255）で大規模な均一な正方形を表示する正方形の中心の輝度を測定し、γを得るために、式1で結果を収めることができます。 精神物理学的手順は、ゼロとフル強度のピクセルと隣接した均質領域内のピクセルのグレーレベル値を決定するのに等しい量の可能性混合物（空間と時間的に）（ように均一で、表示面のいずれかの領域で、作成する必要がているすべてのピクセルが混在したピクセル領域の輝度に心理物理マッチを生成している）同じ強度を持っています。最初に一致し、最大輝度の1/2のグレーレベル値を決定します。輝度強度の1/2、1を持つピクセルの混合物は、3月4日の値を決定するために使用され、この手順が繰り返されるまでの7値f7月8日にROM 1月8日が決定されています。これらの試合は繰り返され、一貫性のための様々なチェックが例えば3/4、1/4試合1/2の混合物ことを確認したとして、作ら​​れています。この手順では、均質領域のBとRの両方のレベルが調整されており、U = B + R / BRratio。結果は、γを得るために式（1）に適合することができます。 我々はL 分 、L maxとγの値を取得した後、我々は、L 0 =（L MAX + L 分 ）/ 2、ピクセルのコントラストC（U）とピクセルのグレーレベルUの関係が背景輝度を設定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="式（2）" />我々は、与えられた対照するために必要なグレイレベルを解くために式を書き直すことができます。 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="式（3）" /> Uは、通常、非整数である。対応するピクセルのRGB値は次のとおりです。R = BRratio * [U-INT（U）]、G = 0、B =int（）はその入力の整数値をとり、int型（U）、。 1.5。正弦波格子のデモ増加したグレースケールの解像度の効果が2の正弦波格子を比較することによって表示することができます。左側の格子は、適切なRとBの値で指定された各ピクセルの強度を持つVideoSwitcherの全容量を使用しています。右側の格子は、その唯一の丸みを帯びたUが8ビットの表示装置の出力を模倣して、各ピクセルのB値として使用されている以外の左のものと同じです。 2。 RTbox 2.1。コンピュータにRTboxを接続する付属のケーブルでコンピュータのUSBポートにRTbox（図4）を接続します。必要に応じてから、デバイスのドライバをダウンロードして<a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> 。ウェブサイト上の指示に従ってドライバをインストールします。 2.2。 RTを使用します。応答時間を測定するためのボックス RTboxは、2つの異なる方法で使用することができます。 ユーザーのプログラムがPsychtoolboxで[8]などの画面によって返された時（ &#39;フリップ&#39;）とPsychPortAudioとして信頼性の高い刺激開始時間を返すことができた場合は、RTboxはちょうどキーボードと同じように使用できます。刺激開始時間とRTboxボタンの時間は、ホストコンピュータとRTboxのクロックをベースにしているため、それぞれ、我々は2つ​​のクロックを同期化する必要があります。これは、バッファ内の不要なイベントをクリアする関数呼び出しRTBox（ &#39;クリア&#39;）で、各刺激の発症に先立って行われます。応答時間は、単純に測定することができますトンRESP = T - tのtonsetユーザプログラムから返された刺激で発症 、およびtは関数呼び出し[T、ボタン]によって返されたボタンを時間である= RTBox（タイムアウト）。 RTBoxドライバが自動的にコンピュータの時刻をホストするためにRTbox時間からボタン時刻を変換するためです。 ユーザーのプログラムができない場合信頼性の刺激開始時刻を返す、刺激オンセットを示すトリガ信号はRTboxに提供する必要があります。一つの解決策は刺激の発症または刺激に同期された光パッチを検出するための光センサを使用することです。光センサの出力は、RTboxの光ポートに接続されています。第二の溶液は、VideoSwitcherのトリガ出力を使用することです。トリガーは直接RTboxのパルスポートに接続することができます。第三の解決策はRTboxのサウンドポートにホストコンピュータのオーディオ信号を接続することです。 VideoSwitcherから刺激開始トリガを生成するために、我々は、視覚刺激の最初のフレームの中央部分の画素の緑チャンネル &quot;オン&quot;に。それは、抵抗ネットワークに寄与しないので、緑のチャネルの信号は、件名には見えません。関数呼び出し[T、ボタン] = RTBoxが（ &#39;パルス&#39;、タイムアウト） &#39;パルス&#39; tを計算するRTboxを指示、応答時間を返します<html>彼は、トリガからの相対時刻を応答。同じ関数呼び出しは、サウンドのトリガに使用されます。光センサのトリガでは、関数呼び出しは、[T、ボタン]は= RTBox（タイムアウト、 &quot;光&quot;）。 3。 VideoSwitcherとRTboxを統合我々は、ディスプレイ、正確な応答時間を収集するRTbox、ERPシステムへのイベントコードと応答を送信するRTboxを制御するためにVideoSwitcherを使用してデモプログラムをプログラムされています。プログラムは、次のサイトからダウンロードすることができます<a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> 。 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：ビデオスイッチャーの写真。それは、VGA入力ポートと出力ポート（両方メス）、2つの表示モードを切り替えるボタンを押すと、トリガ出力ポートを備えています。 ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="図2" /> VGA（A）とDVI-I（B）ポートとDVI-I-VGAアダプタ（C）へ。 図2。写真<img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="図3" /> 図3ビデオスイッチャーの模式図。マルチプレクサは、電圧レベルによって制御される2つの入力モードを持っています。それは回路図に示されているモードであるときは、モニタのRGBチャンネルは同一の信号を受信し、表示モードをグレースケールになりそう。スイッチング電圧は、G-チャネルとスイッチボタンの信号によって制御されるCPLDチップによって生成されます。トリガは、またG-チャンネルの入力によって制御されます。 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。RTboxの写真。それはUSB-Bポート、光入力ポート、パルス/音声入力ポート、外部ボタンの入力ポート、およびTTL出力ポートを備えています。

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ビデオスイッチャーは、高輝度解像度は従来のコンピュータ·グラフィックス·カードとアナログ·カラー·モニターを使用して表示されます。生成するために、コンパクトで安価、かつ簡単に使用できるメソッドを提供します。それは、グラフィックカードとモニタのアナログ出力端子間に接続されています。また、追加の利便性を提供し、単色と色収差の表示モードを切り替えることがで?...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

従来のコンピュータ·グラフィックス·カードに基づいて、表示システムは、8ビットのグレーレベルの分解能で画像を生成することが可能である。しかし、ビジョンの研究でほとんどの実験は、輝度の分解能12ビットを超えるとディスプレイが必要になります。いくつかのソリューションが用意されています。ビット+ 1とDataPixx 2つのアナログディスプレイデバイスを駆動するグラフィックスカード（14ビットまたは16ビット）の分解能の高いディジタル-アナログコンバータからデジタルビジュアルインターフェイス（DVI）出力を使用しています。ここで説明するVideoSwitcher 3は、受動的な抵抗ネットワーク4およびカラーモニターの3つのチャネルに同一のビデオ信号を提供するアクティブ回路を使用して異なる重みを持つグラフィックスカードの赤と青のチャネルからのアナログビデオ信号を兼ね備えています。方法は、従来のグラフィックスカードとアナログモニタを用いた高分解能単色ディスプレイを有効にするには、安価な方法を提供します。それはまた、マークするために使用することができますトリガ信号を提供することができます刺激オンセット、それが簡単に生理的な録音や応答時間の測定値と視覚的なディスプレイを同期させることとなっています。 コンピュータのキーボードとマウスが頻繁に応答時間（RT）を測定に使用されているが、これらの測定値の精度がかなり低くなっています。 RTboxは、正確なRT測定のための特殊なハードウェアおよびソフトウェアソリューションです。 USB接続を介してホストコンピュータに接続され、RTboxのドライバは、すべての従来のオペレーティングシステムと互換性があります。それは、ホストコンピュータは、それらを取得するまでバッファリングされたボタンのイベントのIDとタイミングを記録するためにマイクロプロセッサと高分解能クロックを使用します。記録されたボタンのイベントは、ホストコンピュータのデータ伝送や処理に関連する潜在的なタイミングの不確実性やバイアスの影響を受けません。非同期ストレージが大幅にユーザプログラムの設計を簡素化します。いくつかの方法がRTboxとホストcomputのクロックを同期するためにご利用いただけますえー。 RTboxは、外部トリガを受信し、外部イベントに対するRTを測定するために使用することができます。 ユーザーが購入するためにVideoSwitcherとRTbox両方が用意されています。関連情報と多くのデモンストレーション·プログラムを見つけることができます<a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> 。

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Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

従来のコンピュータのハードウェアは十分な精度で十分に高いグレースケール分解能と測定応答時間を持つ視覚刺激を生成することはできません。我々は、高解像度の単色ディスプレイを生産するVideoSwitcher、従来のコンピュータのハードウェア上で高精度で応答時間を測定するRTboxの使用方法について説明します。

有効にする高解像度を表示し、従来のコンピュータ上で正確な応答時間の測定値をグレースケール

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

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9.3K ビュー.  The Ohio State University. 従来のコンピュータのハードウェアは十分な精度で十分に高いグレースケール分解能と測定応答時間を持つ視覚刺激を生成することはできません。我々は、高解像度の単色ディスプレイを生産するVideoSwitcher、従来のコンピュータのハードウェア上で高精度で応答時間を測定するRTboxの使用方法について説明します。

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

神経科学

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

人間の中脳の高解像度機能的磁気共鳴画像法

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

ヒト皮質下の高分解能構造磁気共鳴イメージング<I&gt;インビボ</I&gt;と死後

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...